自旋與外交加磁場之交互作用即為Zeeman interaction 核自旋也和鄰近的核子自旋、電子自旋及晶格間有交互作用

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所有作用中，只有
H D 的大小與鄰近自旋間的距離三次方成反比。
除 Z RF H 及H 外，這些作用皆具方向性，且這些
方向性與化學鍵的方向有密切的關係。在水溶液
中，當分子的運動速率大於這些作用的大小，則
這些作用也就失去了方向性。我們所能測得的只
是它們的平均值。H D 及HQ 平均值為零，因此在
水溶液H D 及H Q 不存在。(註：H D 不存在只代
表在光譜線上看不到它的作用。

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核磁共振的誕生年代，這往後的15 年是核磁共振. 理論發展的黃金時代。核子自旋與周遭因素之間. 的交互作用理論，核磁弛緩原理以及化學位移現. 象都是這一段期間 ...

自旋與外交加磁場之交互作用即為Zeeman
interaction。由於外圍環繞電子之屏障，核子自旋
所感受的磁場小於外加的磁場，此外核自旋也和
鄰近的核子自旋、電子自旋及晶格間有交互作
用，於是核磁共振所測得的共振光譜已不只是測
量某同位素原子核迴旋磁性常數，更重要的是自
旋已成為一個探頭，可用以探測週遭環境的變
化。

且因外圍環繞的電子分佈並不均
勻，核子自旋所感受到的磁場，也就隨化學鍵與
外加磁場方向之間的夾角而定。H D 代表核子自
旋磁偶矩- 磁偶矩之間的交互作用(dipolar
interaction) 。H Q 則為核子四極矩作用(nuclear
quadrupolar interaction)。它的來源是因環繞核子
旋轉的電子雲作非圓球狀分佈所造成電場梯度與
核子自旋的交互作用，只有I 1 的核子自旋，方
具有核子四極矩作用。H J 係因自旋一自旋偶合
(spin-spin coupling)(又稱J-偶合)的方向性造成。


自旋波理论是1930年由布洛赫首先提出的。设想有一铁磁自旋系统，单位体积内有N个原子呈规则排列，每个原子自旋S=1/2。在温度为0K时，铁磁系统处于基态，由于原子之间存在交换作用，所有自旋平行排列，指向为正向。总的磁化强度M0=NμB（μB为玻尔磁子）。当温度稍有上升，由于热扰动的影响，使得系统中有一自旋翻转，指向反向，则因为相邻自旋之间的交换作用，这一反向自旋将使最邻近的自旋也有翻转的趋势。待邻近自旋反向后，这一原先反向的自旋又回到正向取向，由此类推，意味着一个反向自旋实际上不可能停留在系统的格点上不动，而是形成了反向自旋在晶体中的传播，称为自旋波。随着温度继续升高，有更多的自旋被反向，饱和磁化强度的下降可看成是更多的反向自旋波被激发。显然，自旋反向是等概率地分布在系统包含的所有格点上，而每个格点自旋的翻转概率仅为单个反向自旋的1/N，因此，激发自旋波的能量远低于单个反向自旋的能量。在低温下，热运动能量很小，单个自旋翻转的概率也小，但是照样可以激发自旋波。自旋波理论指出，对于长波近似，自旋波的色散关系为ωk=Dk2（D是自旋波的劲度系数，ωk是波矢为k的自旋波的圆频率），同时，低温下的各个自旋波可以看成是独立的，总能量等于所有自旋波的能量之和。理论预言低温下铁磁体的自发磁化强度与温度T的关系服从T3/2律，即Ms=M0(1-CT3/2)，这里的C为常数，这一温度依赖性已为磁性过渡金属低温磁性的实验研究所证实。

根据量子力学，波的最小能量量子为（，h为普朗克常数）。对于自旋波而言，一个自旋翻转后，系统的能量由于反向自旋和最近邻自旋间的交换作用能的增大而增大。因此，每多翻转一个自旋，最小的能量增量就等于。另外，波矢为k的自旋波还具有准动量hk。这就是说，自旋波的能量和动量都是不连续变化的，表现出一种量子的特性。所以，自旋波的行为除了具有波动性外，还具有粒子性。正因为这样，自旋波又叫做磁振子或磁激子

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

利用核磁共振光譜學探討蛋白質的

結構、動性及功能

黃太煌

中研院生科所

E-mail : bmthh@ibms.sinica.edu.tw

核磁共振的發展史,是科學研究的最好範例，

在多次的山窮水盡中，發現了每次的柳岸花明。

從 Pauli 核子自旋的假設，經 Estermann 和 Rabi 以

Stern-Gerlach 實驗設施證實其存在，到 Purcell 及

Bloch 在 1945 年以共振法測定核子自旋，真正的

打開了核磁共振的大門。一般人將 1945 年當做是

核磁共振的誕生年代，這往後的 15 年是核磁共振

理論發展的黃金時代。核子自旋與周遭因素之間

的交互作用理論，核磁弛緩原理以及化學位移現

象都是這一段期間建立及發現的。六十年代最大

發展，應屬於 Ernst 及 Anderson 將傅力葉轉換原

理應用到核磁共振上，六十年代末期，一般人認

為核磁共振理論研究已進入死胡同。這一思想在

七十年代開始很快的就被固態核磁共振的快速發

展及生醫方面的應用所淹没。Jeneer 二維共振的

理論，及核磁影像的構想也都在七十年代提出，

而在八十年代才發展成熟。醫院裡開始使用磁振

造影儀(MRI)，生化學家也真正能以核磁共振光譜

學法，來決定生化巨分子在水溶液中的結構。當

然在這發展過程中超導磁鐵技術的進步，電腦速

度的高速成長，磁碟容量擴大等都有決定性的影

響。另外新理論的發展，如乘績運算子(product

operator)的普遍運用，也促進核磁共振技術的發

展。半個世紀以來，核磁共振由一物理學家好奇

探索的現象，而成為生、醫、理、工等各領域裡

廣泛應用，甚至於是不可或缺的先進技術。它的

成就，又一次的證實基礎科學研究的重要性。

Ι. 核磁共振的基本原理：

自然界存在的同位素中約有一半具有核子自

旋，在探討生化巨分子較重要的包括 1H,13C,15N

及 31P。這些原子核皆具 I=1/2 的核子自旋，因此

每原子核皆擁有磁偶矩 µ=γhI，式中 γ 為迴轉磁性

比(gyromagnetic ratis)。γ 隨不同原子核而有不

同，γ( H

1

)為 4.2577 KH Z /G，這些原子核放置於

磁場 0

H 中將分佔於具-γħ

'

H 0 /2 及 γħH 0 /2 兩能層

中，此二能層之能量差為：

∆E=γħH 0 =ħω 0

以　上　式　子　稱　為　拉　莫　爾　方　程　式 (Larmor

equation)，而ω 0 =γH 0 稱為拉莫爾頻率，亦即核

子自旋在磁場 H 0 下之共振頻率，此頻率隨原子

E=0

γħH0/2

-γħH0/2

∆E = γħH0

H = 0

H = H0

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

核種類及磁場之高低而異，目前市面上買得到的

最高核磁共振級的磁鐵磁場為 21 萬高斯(21Telsla)

在此磁場下質子之共振頻率為 900MH Z 。

. 核磁共振之基本作用：

自旋與外交加磁場之交互作用即為 Zeeman

interaction。由於外圍環繞電子之屏障，核子自旋

所感受的磁場小於外加的磁場，此外核自旋也和

鄰近的核子自旋、電子自旋及晶格間有交互作

用，於是核磁共振所測得的共振光譜已不只是測

量某同位素原子核迴旋磁性常數，更重要的是自

旋已成為一個探頭，可用以探測週遭環境的變

化。圖一描述核子自旋和週遭交互作用七種可能

性。核磁共振光譜反應出核子自旋( )與外在磁場

交互作用的結果，外在的磁場包括外加靜磁場

(H 0 )及振動磁場(H1 )和核子自旋周遭核子及電子

造成的局部磁場(local field)。這些交互作用，可

以下列的核子自旋總位能方程式表式(H)：

J

Q

D

CS

RF

Z

H

H

H

H

H

H

H

+

+

+

+

+

=

(1)

HZ 是所謂的 Zeeman 作用，它是 I 和外在靜

磁場 H 0 的交互作用。H RF 是 I 和外在振動磁場

H 1 的交互作用。HCS 代表化學位移方向性作用

(chemical shift anisotropic interaction)。它是因為環

圖一. 基本核磁共振交互作用

1. Zeeman Interaction of spins; 2. Direct spin interaction.

3. Nuclear spin-electron interaction an dindirect spin interaction

3-5: Indirect spin lattice interaction via electrons.

3-6: Shielding and polarization of nuclear spins by electrons.

4: Direct spin-lattice interaction;

4-7: Coupling on nuclear spins to sound fields etc.

Electrons

Nuclear

Spin I

Nuclear

Spin S

Phonons

6

External

Field

(Ho & H1)

3

3

1

2

4

4

7

1

5

External

Field

(Ho & H1)

繞核子旋轉的電子與外加磁場的交互作用，使得

核子自旋所承受的磁場不一樣，以致其共振頻率

也就不一樣。且因外圍環繞的電子分佈並不均

勻，核子自旋所感受到的磁場，也就隨化學鍵與

外加磁場方向之間的夾角而定。H D 代表核子自

旋磁偶矩 - 磁偶矩之間的交互作用 (dipolar

interaction)。H Q 則為核子四極矩作用(nuclear

quadrupolar interaction)。它的來源是因環繞核子

旋轉的電子雲作非圓球狀分佈所造成電場梯度與

核子自旋的交互作用，只有 I 1 的核子自旋，方

具有核子四極矩作用。H J 係因自旋一自旋偶合

(spin-spin coupling)(又稱 J-偶合)的方向性造成。

表 1 列出各種交互作用在二萬三千高斯磁場

下　的　數　值　範　圍　。　在　上　述　交　互　作　用　中

CS

RF

Z

H

HH 與

,

皆與磁場強度成正比。而

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

H

J

Q

D

H

H

,

與磁場強度無關。所有作用中，只有

H D 的大小與鄰近自旋間的距離三次方成反比。

除

RF

Z

H

H 及

外，這些作用皆具方向性，且這些

方向性與化學鍵的方向有密切的關係。在水溶液

中，當分子的運動速率大於這些作用的大小，則

這些作用也就失去了方向性。我們所能測得的只

是它們的平均值。H D 及 HQ 平均值為零，因此在

水溶液 H D 及 H Q 不存在。(註：H D 不存在只代

表在光譜線上看不到它的作用。核子自旋相互之

間，仍可藉由 H D 交換能量，影響相互之間的光

譜線強度。這就是所謂的 nuclear Overhauser effect,

NOE)。HCS 之平均值則不等於零，而為一常數，

稱之為化學位移(chemical shift)。同樣的 H J 平均

值稱為 J-偶合係數(J-coupling constant)。

兩核子自旋之間的磁偶矩交互作用具對稱

性，是所有作用中最容易分析的。以兩個孤立的

核子自旋，或在單晶或同向樣品(single crystal or

oriented sample)的磁偶矩對為例，磁偶矩的交互

作用，使得原先的一根光譜線，分裂為二根，此

對線(doublet)之間的頻率差， v D ，可以下列式

表示 :

v D =

=

−)1

cos3(

4

2

3

1

θ

γ

γ

R

hS

11 (3cos

2 θ 1) (2)

θ 是外加磁場向與連接兩核子之向量間夾角。γ

是迴轉磁比(gyromagnetic ratio)，R 是兩核子之間

的距離，h 為普朗克常數。對特定的自旋對而

言，方程式中唯一變數是磁場方向與連接兩核子

之向量夾角。 v11 則為磁偶矩作用的最大值。

III. 核磁共振的基本參數：

1. 共振線強度：

共振線面積和樣品之濃度成正比，同一化合物

之不同共振線之面積則和該功能基具有之核子

自旋數成正。

2. 化學位移：

一核子自旋之共振頻率，因其化學結構而異，

圖二顯示牛蛙卵核醣核酸酶之質子共振光譜，

不同功能基之共振位置也已標定在圖上，圖上

可見不同官能基之共振位置不一，且不同胺基

酸之同一種官能基之共振頻率亦非完全相同，

而有一定範圍，由這些許的差別，讓我們可以

標定不同胺基酸之所有核子自旋共振頻率(化學

位移)。

圖二. 牛蛙卵核醣核酸分解酶　一維核磁共振光譜

3. J-偶合(J-Coupling)：

核子自旋可經由化學鍵產生偶合現象，譬如

1HN 之質子可和鄰接的 Cα 質子經由 1HN-1Hα產

生三鍵偶合(

3

J α

HN )。其偶合之大小，因胜

面之双面角而異，數值約為 4-12H Z 之間，因

此測定

3

J α

HN

可間接的測得胜面之双面角

φ 。

4. 核　子　歐　豪　效　應 (Naclear Overhauser Effect,

NOE)：

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

NOE 係核子自旋，藉由磁偶矩之交互作用而產

生磁性轉移之現象。NOE 之大小和兩核子自旋

之距離六次元成反比，同時也受核子自旋本身

動性之影響，因此測定 ij

σ 可測定質子間之距

離。

5. 核子自旋弛緩時間 (Relaxation time)：

核子自旋和晶格而互換能量，而失磁性，此在

Z 一方向之磁性弛緩現象稱之為自旋－晶格弛

緩(Spin-Lattic relaxation，T1)。此外自旋與自旋

間相互作用，導致在 x-y 平面上失去磁性相位

同步性的現象稱之為自旋－自旋弛緩(Spin-Spin

relaxation，T2)。T1 及 T 2 之大小，主要受到巨

分子本身動性之影響，因此測定 T1 及 T 2 可間

接算出巨分子之動性(Dynamics)。

IV. 蛋白質結構的特徵：

蛋白質是 20 種 L 型胺基酸串聯而成，每一胺

基酸有其特定的

?

C

O

R

l

C

NH

−

⇓

−

−

−

架。骨架在空間

上的折疊，而形作蛋白質的結構。由於不同胺基

酸邊鏈各異，也相對的影響其骨架結構。因此蛋

白質的結構又可區分為骨架結構及邊鏈的結構。

骨架結構決定蛋白質立體空間的摺疊，而邊鏈的

結構，決定蛋白質的特定功能。骨架的結構又可

分為四層次：一級結構指蛋白質胺基酸的序列。

二級結構指蛋白質片斷之特殊規則排列。目前發

現有三種主要的規則式樣，即 α-螺旋(α-helix)，β-

摺片(β-sheet)及轉折(turn)。不符合此三種式樣的

結構則統稱為零散線圈(coil)。“三級結構”則指整

個蛋白質單鏈的三度空間折疊。有些蛋白質是由

多鏈組成的。每一單鏈有其特定的三級結構。所

有單鏈的三級結構，又組合而成一“四級結構”。

蛋白質結構的另一特點是每一胺基酸的 N i -

H 鍵都與前一固胺基酸的， C 1

−i

=O 鍵及

(CO)

α

C

i

−

−1

鍵共平面，而形成一胜面(圖三)。

而每一蛋白質的骨架結構，又可以串聯而成胜

面來表示。因此，只要能準確地決定每一胜面

在空間上的方向，也就能決定蛋白質骨架的結

構。當然，另一種決定蛋白質骨架結構的方法，

是測得每一原子的立體座標。這是液態核磁共

振，決定蛋白質在液體中結構的方法。理上此法

可以完整的決定蛋白質在固態中的結構，但實際

上卻非最適合的方法。目前最有效的方法是二法

一齊用。決定胜面的方向，以決定骨架的摺

疊，再以定點距離測定方法，決定蛋白質邊鏈的

結構，或者是骨架中某部份的結構，以此兩互補

的方法，同時應用，才能決定完整的蛋白質結

構。

圖三. 蛋白質骨架胜肽平面結構圖

V. 蛋白質結構之決定：

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

(1)

P repare

N M R sam ples

2H ,13C and/or 15N -

Labeled

(3)

A ssign

N M R

resonances

(2)

O btain

N M R spectra -

(1D ,2D ,3D & 4D )

(4)

O btain

N M R restraints

distances,

dihedralangles

bond orientations

(5)

S tructure

C alculation

and

refinem ent

圖四. 決定蛋白質結構步驟

圖四列出利用核磁共振法決定生化巨分子之

步驟如下：

1. 樣品之取得：

核磁共振之最大優點是它可以直接決定純化

的蛋白質在水溶液中之結構。所需樣品量約 0.4

毫升濃度 1mM，以分子量為一萬道爾頓之蛋白

質，其重量約為 4 毫克，另一需求為蛋白質必須

以

13

C 及

15

N 標定，因

13

C 在自然界中含量為

1.1%，

15

N 為 0.1%，因此為了取得

13

C 及

15

N 標

定之蛋白質，首先必須將蛋白質的基因結構植入

大腸桿菌，然後將大腸桿菌培養於含

13

C 之葡萄

醣及

15

NH 4 Cl 中。

2. 光譜之取得：

由於蛋白質光譜相當複雜，為求增加解析度

及靈敏度，光譜必須在高磁場下取得，一般至少

在 500MH Z 以上之光譜儀才足以勝任，此外仍須

考慮以下因素：

a.選擇性測定特定作用：在核子自旋系統中，

多重作用同時存在，使得光譜過度複雜，在

單一實驗必須壓抑大部份之作用，而只選擇

性觀察其中一種作用，如 NOE，J-Coupling

或 dipolar effect。

b.間接測定靈敏度低的核子自旋：

13

C 及

15

N

之靈敏度為

1

H 之 1.6%及 0.1%，欲測得這

些低靈敏度之核子自旋，一般皆利用 J-

Coupling 將其磁性轉移到

1

H，作間接之測

定，以提高靈敏度。

c.多維核磁共振光譜：一個分子量為一萬之小

蛋白質，其

1

H 數在 500 個以上，一般一維

共振光譜線重疊非常嚴重，無法分辨，必須

在二維及多維光譜上方能有足夠之解釋度，

加以分辨所有光譜線，及進一步標定所有光

譜線。

d.水光譜線之壓抑：溶液中水之

1

H 濃度為

110M，而蛋白質之樣品濃度為 1mM，之間

相差 10

5

，假如實驗時不壓抑水之信息，則

蛋白質之信息將無法偵測，這是所謂的

Dynamic Range 的問題。

3. 脈沖系列之設計：

核磁共振之發展日新月異，近年來許多相當

聰明的脈沖系列已被發展出來，解決以上所提的

種種問題，圖五顯示二維光譜之基本示意圖，此

圖五. 二維核磁共振原理

脈　沖　系　列　所　得　之　光　譜　為　異　核　關　聯　光　譜

(Heteronuclear Correlated Spectrum, HETCOR)。以

1

H 和

13

C 為例子，在

1

H 和

13

C

到平衡狀況

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

後 (預備期) 首先以一 90之脈沖將

1

H 翻轉到 x-

y 平面上，讓

1

H 之核子自旋在此平面上自然演

化 t1 時間，且在

2

1

t1 時，注入

13

C 之 180脈

沖，以消除

1

H-

13

C 之偶合，且為

1

H 之演化

期，接著讓

1

H-

13

C 偶合在一起，以將

1

H 磁性

轉化到

13

C 核子自旋上，此為磁性轉換期，接下

來為

13

C 之偵測期，偵得之信息加以傅利葉轉換

後，即為

13

C 之一維光譜，如此實驗，重複多

次，每次增加固定量之 t1 ，自 0 to n t1 ，則此二

系列之信號，作兩次傅利葉轉換後，即為

1

H-

13

C 關聯的二維異核光譜，此光譜第一度空間為

1

H 而第二度空間為

13

C，譜上只有

1

H-

13

C 偶

合之核子自旋才能顯現出來，至於單獨之

13

C，

如-C=0 則不能顯現出。

90

90

180

t1

t2

(a) NOESY

90

90

t1

t2

(b) COSY

90

SL

SL

t1

t2

(c) TOCSY

t1

MLEV-17

圖六. 同核二維核磁共振脈沖系列

圖六為一組同核二維脈沖系列，實驗結果之

二維光譜鳥瞰圖如圖七所示，其對角線為一般的

一維光譜，而其非對角線上之交叉峰(Cross peak)

之強度，顯示縱座標及橫座標所示化學位移之兩

共振線交互作用之大小，如實驗為 NOESY，圖六

(a)，則非對角線上之交叉峰代表相對之兩共振線

距離相距在 6Å 內，交叉峰之強度亦可用以計算

相對應兩核子自旋之距離，依此類推，如光譜為

COSY，圖六(b)或 TOCSY，圖六(c)，則非對角線

之線峰之存在代表相對兩核子自旋以共價鍵結合

在一起(COSY 及 TOCSY)或相隔 2-4 個共價鍵

(TOCSY)，COSY 及 TOCSY 之光譜亦可用來標定

共振線。

圖七. 二維核磁共振原理

圖八為另一系列之標準異核多維光譜，圖八

(a)顯示蛋白質骨架上核子自旋間之偶合常數，藉

由這些偶合現象，可將磁性隨意的移轉，圖六(b)

為 HNCO 異核三維脈沖系列。圖八(c)為三維

HNCA 脈沖系列，此兩系列所得為

1

H-

15

N-

13

C

三維光譜。磁性自

1

H N 先傳到 15N 再傳到 13CO

或

13

C α 因此可偵測鍵結合在一起的

1

H N ，

15

N H 及 15CO 或

13

Cα 。藉此可完整標定骨架之

1

H N ，

15

N H 及 15CO 或

13

Cα 共振線。依此類

推利用圖六這一組實驗可完整標定所有骨架之共

振線。

---

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■ 409 ■

物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

Magnetization transfer pathway:

1H → 15N → 15N Chemical shift evolution

→ 13C → 13C CS evolution

→ 15N → 1H → 1H Detection

圖八. 異核三維核磁共振脈沖

系列

4. 結構限制條件(Structural Restraints)：

核磁共振光譜法可取得以下結構的限制：

a)距離：

兩核子自旋之間的距離，可由 NOESY

上取得，理論上交叉峰之強度與距離之關係

可用數學式子表示，然因蛋白質上的原子並

非固定不動，因此難以量化，一般將之區分

為強、中、弱、很弱四種，其相對應之距離

限制則設定為 1.8-2.5Å ， 1.8-3.5Å ， 1.8-

4.5Å，1.8-5.5Å。這樣之限制在結構計算上雖

稍歉寬鬆，但數百或數千個這些稍寬之限制

同時存在時，彌補了寬鬆的缺點。

b)双面角(Dihedral angle)：

蛋白質骨架胜面間之夾角可用兩双面

角φ及ψ來表示(圖三)，其中φ角可由

1

H N 及

1

H α 之 J-Coupling 求得，其關係稱之為

Karplus equation。

3

J α

HN =6.4cos

2

(φ-60

0

)-1.4cos(φ-60

0

)+1.9 (3)

3

J α

HN 可由 COSY 或 HNHA 實驗測得，此外

邊鏈之夾角也可由邊鏈間之 J-偶出。

c)氫鍵(Hydrogen bond)：

蛋白質結構之二級結構α -螺旋或 β -平

板可利用 NMR 光譜線之化學位移指示

(Chemical Shift Indices，CSI)測得，由於這些

二級結構主要靠胜骨架 NH 及 C=0 氫鍵之

形成而得以穏定存在，由 CSI 及特殊 NOE 圖

樣判定為某種二級結構之區段結構可用氫鍵

加以限制。

d)殘存磁偶矩(Residual dipolar coupling)：

兩核子自旋之間的磁偶矩交互作用具方

向性，其關係如方程式(2)所示。以

1

H-

15

N

為例，其 ∆ν D ∼40KH Z ，但一般蛋白質在水

溶液中快速旋轉，其磁偶矩交互作用時間平

均值為零，也就失去方向性。假如在水溶液

中，加入能成液品之介質，使蛋白質之轉動

受到方向的限制，則這些磁偶矩之時間平均

不再為零，此即為殘存磁偶矩，其數值大約

為原數值之 0.1%，在蛋白質結構研究上最有

用的偶矩為骨架上之 1H-15N, 1H-13Cα，

13

Cα -

13

C=0，及

15

N -

13

C。測得這些磁偶矩後，

可用方程式(2)算出它們和磁場間之夾角，以

決定胜平面之相對方向。因殘存磁偶矩量

得之方向以磁場為參考方向，因此為長程之

規律，相反的 NOE 及双面角皆屬短程規律

性，利用短程規律性算出之結構，常有長程

規律失真現象，利用殘存磁偶矩可消除這些

顧慮。

5. 結構之計算：

結構計算的第一步，是以正確之鍵長建構欲

決定結構蛋白質之起始結構，外加以 NMR 取得

之結構限制，利用計量矩陣距離幾何運算(metric

matrix distance geometry)配合分子動態(Molecular

---

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■ 410 ■

物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

dynamics)及模擬焠熄(Simulated annealing)方法，

計算出最符合結構限制且能量最低之結構。分子

之能量包括下列項目：

Etotal =Ebond +E dih +Eimproper +EVDW +E dih

+E NOE +E RDC +..

(4)

其中

Ebond =Σkb (b-b 0 )

2

為化學鍵能

E dih =Σkφ (

φ

φ − 0 )

2

+Σk Ψ ( Ψ - 0

Ψ )

2

雙

為面角相關能量

Eimproper =Σkimproper (ω - ωo)

2

為胜平面變形

能

E VDW 能 van der Waals 作用能，一般以

Lennard - Jones 位能表示

E NOE =Σk NOE (r-r 0 )

2

為 NOE 差別之處罰位

能(Penalty potential)

E RDC =Σk RDC (θ -θ 0 )

2

為殘餘磁偶矩處罰

位能

通常利用一組的結構限制會利用不同之起始結構

重覆計算 50-100 個結構，選取其中不違背結構限

制且能量最低之 20 個結構加以進一步之分析，且

計算出平均結構，加以能量最小化後，作為代表

結構，圖九為 20 個牛蛙卵核醣核酸分解酶骨架結

圖九. 20個牛蛙卵核醣核酸分解酶

骨架

構之重疊圖，NMR 結構之最大特色為部份重疊相

當好，但部份則很鬆散，鬆散部份通常為較具動

態之部份。

6. 結構之分析：

a)蛋白質電性分佈：

圖十顯示牛蛙卵核醣核酸分解酶表面電

性之分佈，白色為不帶電部份，紅色為帶負

電區域，藍色為帶正電區域，從此圖可以正

確的判斷藍色凹下部份為和帶負電之核醣核

酸(RNA)之結合區。圖 9 顯示在此區域內之

活性中心相關胺基酸之結構，不同顏色表示

不同核醣核酸酶，由於這些胺基酸排列之些

許差異造成其功能上之差異，並可用以作為

理性藥物設計之藍圖。

圖十. 牛蛙卵核醣核酸分解酶

b)蛋白質之動性：

蛋白質分子在生理狀況下，內部的部份

屬於動態狀況，這些動態影響蛋白質功能甚

巨，核磁共振法為探討蛋白質動性之最佳方

法，蛋白質的動性可由分析 15N 核子自旋―

晶格弛緩時間(Spin–Lattice relaxation time，

T 1 )，核子自旋―自旋弛緩時間(Spin–Spin

relaxation time ,T 2 )及

1

H-

15

N 之 NOE(XNOE)

---

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■ 411 ■

物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

取得。T1 ,T 2 及 XNOE 與動性之關係如下所

示：

1

1

T

=(d 2 /4)

[

])

(6)(3)

(

N

H

N

N

H

J

J

J

ω

ω

ω

ω

ω

+

+

+

−

+C 2 J(ω N )

2

1

T

=(d2/8)

[

])

(6)(6)(3)

(

)0(4

N

H

H

N

N

H

J

J

J

J

J

ω

ω

ω

ω

ω

ω

+

+

+

+

−

+

＋(C2/6)[

]

)(3)0(4N

J

J

ω

+

+Rex

(5)

XNOE=1+(d

2

/4)(r H /r N )

[

])

()

(6

N

H

N

H

J

J

ω

ω

ω

ω

−

−

+

T1

式中：d 為與磁偶矩相關常數，c 為與化學位移方

向性相關常數 J(ω)則為光譜密度函數(Spectral

density function)。此函數之形式隨動性之模式而

變，如假設蛋白質分子為一堅硬體(rigid body)，

且部份結構可作快速內部獨立運轉，則 J(ω)可簡

化成以下形成：

J(w)=

















+

−

+

+

−

+

+

2'

'

2

2

2

'

'

2

2

2

)(1

)

(

)

(1

)

1(

)

(15

2

s

s

f

f

f

f

m

m

S

S

S

S

ωτ

τ

ωτ

τ

ωτ

τ

(6)

式中 S 為規律常數(Order parameter)(0≤S≤1)，S＝

1 代表該點無動性，S=0 則表示該點作快速無方向

性之運轉。 m

τ 為分子整體旋轉之關連時時間

(Overall correlation time)，S f 為內部運動轉之規

律常數，

'

f

τ 為內部快速運轉之關聯時間，

1'

s

τ 為

緩慢的內部運轉關聯時間，因此由 T 1 ，T 2 及

XNOE 數據可算出各核子自旋之多種運動相關參

數，圖十一(a)顯示大腸桿菌硫酯酶之靜態結構，

圖十一(a)顯示大腸桿菌硫酯酶之骨架 N

15

之規律

常數，S。(b)中管子之中心位置為蛋白質骨架之

位置，管子之粗細與 S 成反比，此圖顯示大腸桿

菌硫酯酶之活性中心具高度動態，此動態與其催

化能力及受子之專一性之間有直接之關連。

(a)

(b)

圖十一.(a)大腸桿菌硫酯酶

;

(b)骨架15NH之規律常數 ,S 。

. 結論：

後基因體時代的來臨也掀開了蛋白質體學研

究時代的序幕，探討蛋白質的結構是今後生命科

學研究的主要課題，核磁共振光譜學在這方面研

究的重要性更為突出，為了加強此方面之研究，

特別在國家基因體醫學計劃項下規劃成立高磁場

液態核磁共振核心設施，添購多台 800MH z 及

600MH z 核磁共振光譜儀，並裝備低溫超導探

頭，以增加其靈敏度，相信在這些儀器相繼安裝

運轉後，台灣的生化巨分子核磁共振研究將可更

上層樓。由於核磁共振光譜學理論對學生物學生

較為艱深,此一領域卻也成生物物理學家的天堂。

VII. 參考資料：

1. Abragam, A. (1961). The Principles of Nuclear

Magnetism, Chap. VIII pp. 164-322, Clarendon

Press, Oxford, UK.

2. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G. &

Skelton, N. J. (1996). Protein NMR Spectroscopy -

Principles and Practice, Academic Press, San

Diego.

---

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物理雙月刊（廿四卷三期）2001 年 6 月

3. Chang, C. F., Chen, C. P., Chen, Y. C., Hom, K.,

Huang, R. F. & Huang, T. H. (1998). The Solution

Structure of a cytotoxic Ribonuclease from the

Oocytes of Rana catesbeina (Bullfrog). J. Mol. Biol.

283, 231-244.

4. Huang, Y. T., Liaw, Y. C., Gorbatyuk, V. Y. &

Huang, T.-h. (2001). Backbone dynamics of

Escherichia coli thioesterase/protease I: Evidence

of a flexible active-site environment for a serine

proease. J. Mol. Biol. 307, 1075-1090.

5. Lin, T. H., Chen, C. P., Huang, R. F., Lee, Y. L.,

Shaw, J. F. & Huang, T. H. (1998). Multinuclear

NMR resonance assignments and the secondary

structure of Escherichia coli thioesterase/ protease I:

A member of a new subclass of lipolytic enzymes.

J. Biomol. NMR, 11, 363-380. J. Biomol. NMR 11,

363-380.

6. Wuthrich, K. (1986). NMR of Proteins and Nucleic

Acids, Wiley Interescience, New York.

7. 科儀新知第五卷第一期民國七十二年七月 17-33.

8. 科儀新知第十五卷第六期民國八十年六月