所谓相差是指两束光波在某一位置时，由于波峰和波谷不一致，即存在着相位上的差异，叫相差。同一种光通过细胞时，由于细胞不同部分的折射率不同，通过细胞的光线比未通过细胞的光线相位落后，而通过细胞核的光线比通过细胞其他部位的相位落后，这就是相位差

第二章细胞生物学研究方法

1．举例（3～5个）说明研究方法的突破对细胞生物学发展的推动作用。
答：①细胞培养技术，…
②离心分离技术，…
③流式细胞分离技术，…
④基因敲除技术，…
⑤干细胞培养技术，…
⑥ … …
2．为什么说细胞培养是细胞生物学研究的最基本技术之一？
3．用什么方法追踪活细胞中蛋白质合成与分泌过程？包括哪几个步骤？
答：追踪活细胞中某种蛋白质合成与分泌的过程一般采用同位素示踪技术。其基本步骤是：①将放射性同位素标记的氨基酸(3H－亮氨酸)加到细胞培养基中，在很短时间内使这些与未标记的相应氨基酸化学性质相同的标记分子进入细胞(称为脉冲标记)；②除去培养液并洗涤细胞，再换以未标记氨基酸的培养基培养细胞，已进入细胞的标记氨基酸将被蛋白质合成系统作为原料加以利用，掺入到某种新合成的蛋白质中；③每隔一定时间取出一定数量的细胞，利用电镜放射自显影技术探查被标记的特定蛋白质在不同时间所处的位置。通过比较不同时间细胞取样的电镜照片就可以了解细胞中蛋白质合成及分泌的动态过程。
4. 图2-3的解释。
答：两个儿童共同振动一根绳子产生的波动类似于光子光子和电子形成的波，以此说明物体的大小对波的干扰。(a)两个儿童振动绳子产生的特征波长;(b)向绳子波中扔进一个球或一个物体，如果扔进物体的直径与绳子波长相近，就会干扰绳子波的移动;(3)如果扔进一个垒球或其他物体比绳子波长小得多，对绳子波的移动只有很小或没有干扰;(d)如果将绳子快速振动，波长就会大大缩短;(e)此时扔进垒球就会干扰绳子波的移动。
5．为什么电子显微镜需要真空系统(vacuum system)?
答：由于电子在空气中行进的速度很慢，所以必须由真空系统保持电镜的真空度，否则，空气中的分子会阻挠电子束的发射而不能成像。用两种类型的真空泵串连起来获得电子显微镜镜筒中的真空，当电子显微镜启动时，第一级旋转式真空泵(rotary pump)获得低真空，作为二级泵的预真空；第二级采用油扩散泵(oil diffusion pump)获得高真空。
6．什么是相位和相差?
答：所谓相位是光波在前进时，电振动呈现的交替的波形变化。由于光是电磁波，其电振动与磁振动垂直，又与波的传播方向垂直，导致了传播时波形的变化。同一种光波通过折射率不同的物质时，光的相位就会发生变化，波长和振幅也会发生变化。所谓相差是指两束光波在某一位置时，由于波峰和波谷不一致，即存在着相位上的差异，叫相差。同一种光通过细胞时，由于细胞不同部分的折射率不同，通过细胞的光线比未通过细胞的光线相位落后，而通过细胞核的光线比通过细胞其他部位的相位落后，这就是相位差。
7．与光镜相比， 用于电子显微镜的组织固定有什么特殊的要求?
答：比光镜的要求更高。首先是样品要薄，这是因为电子的穿透能力十分有限，即使是100～200kV高压，电子穿透厚度仅为1μm。通常把样品制成50～100nm厚的薄片(一个细胞切成100～200片)，称超薄切片(ultrathin section)。其次是要求很好地保持样品的精细结构，特别是在组织固定时要求既要终止细胞生命，又不破坏细胞的结构。第三是要求样品要具有一定的反差。电子显微镜的样品切片最后被放置在载网上而不是玻片上。
8．什么是细胞分选？基本原理是什么？
答：用流式细胞计将特定的细胞分选分选出来的技术， 分选前， 细胞要被戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。当结合有荧光染料的探针与细胞群温育时，探针就会同具有特异表面抗原的细胞紧紧结合，由于抗体的结合，被结合的细胞带上了荧光标记。细胞被标记之后，除去游离的抗体，并将细胞进行稀释。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子成为一种标签。当液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器(interference detector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。如果是含有非荧光标记细胞的液滴进入激光束，只会被干涉检测器检测到，结果使充电信号将液滴的鞘液带上正电荷，从而在移动时偏向负极，被非荧光标记细胞收集器所收集。如果是不含有细胞的液滴进入激光束，则不会被任何检测器所检测，因而不会产生充电信号，液滴的鞘液不会带上任何电荷，所以在移动时不受任何影响直接进入非检测的收集器。
9．什么是细胞培养， 应注意哪些问题?
答：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。细胞培养的突出特点是在离体条件下观察和研究细胞生命活动的规律。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。然而，细胞在体外环境的局限性，又使细胞的形态与功能不能与体内的同类细胞完全等同。体外培养细胞必需注意三个环节∶物质营养、生存环境和废物的排除。体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的。培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素。一般培养细胞所用的培养基是合成培养基，它含有细胞生长必需的营养成分，但是在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，以牛血清为主。这是因为血清中含有多种促细胞生长因子和一些生物活性物质。由于血清中含有一些不明成分，对于特殊目的细胞培养是不利的。为此，研究人员正在探索无血清培养细胞的条件，并已经取得一些进展。由于机体内的细胞生长通常需要不同的细胞因子进行调节，所以在无血清培养时仍然需要添加必要的因子，包括：促细胞生长因子(如EGF)、促贴附物(如层粘连蛋白)和其它活性物质(如转铁蛋白)。无血清培养排除了有血清培养时血清中不明因素的干扰，使实验结果更加可靠。体外细胞培养必需模拟体内细胞生长的环境。环境因素主要是指∶无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境。气体主要有两种∶O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。活体内生长的细胞所产生的代谢物和废物通过一定的系统进行利用和排除。体外培养细胞产生的代谢物和废物积累在培养液中，所以定期更换培养液，对于体外细胞培养也是至关重要的。
10．什么是细胞系和细胞株?
答：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell strain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。
11．动物体细胞克隆有什么意义?
答：动物体细胞克隆技术的成功对生命科学的发展具有重要的推动作用，不仅证明了动物的体细胞具有全能性，而且有巨大的应用前景。例如结合转基因技术生产药物。现在很多药物如胰岛素、生长激素、表皮生长因子等都是动物细胞体内正常的代谢物，某些病人由于产生这些物质的功能发生缺陷，导致了相应疾病的发生，目前的治疗方法就是给这些病人注射这类药物。由于这类药物本身是来自动物的某些脏器，制备这种药物就需要大量的动物提供脏器，因此成本就很高，如果通过转基因技术把相应的基因转入到哺乳动物，让动物的乳汁生产具有疗效的蛋白质就会降低成本，再结合动物体细胞克隆技术，将这种转基因动物大量无性繁殖克隆，就可以大大提高产量，大幅度降低成本，同时也保证了所转基因的稳定。该项技术也可以生产供动物本身和人类器官移植的动物，解决器官捐赠长期缺乏的问题。另外，动物体细胞克隆技术在基因结构和功能、基因治疗、遗传病及人类衰老等的研究方面都具有巨大的潜力。
12．蔗糖、甘油和氯化铯都是密度离心分离中的介质，它们在性质上和使用上有什么不同?
答：CsCl可自行形成密度梯度，所以不必特别制备密度梯度，只要将待分离的样品与之混匀即可。在离心的过程中，具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配;而蔗糖和甘油要人工置备密度梯度。蔗糖和甘油的最大密度为1.3g/cm3 ，所以只能用于分离密度在 1.3g/cm3以下的细胞器或细胞结构;而氯化铯的最大密度可达1.9g/cm3以上， 可用于分离密度大于1.3g/cm3的DNA分子。在原理上，由于具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配，所以又称为浮力密度离心(buoyant density centrifugation); 而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于密度的不同而被阻止在不同的部位，故是重力密度离心。
13．离子交换层析的原理是什么?
答：离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。
14．何谓乳腺生物反应器， 它的出现有什么意义?
答：乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。乳腺生物反应器是一项综合技术，发展乳腺生物反应器不仅需要基因工程技术，也需要动物胚胎技术，转基因技术，蛋白质提纯技术和常规畜牧技术。乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器生产药品，基本上是一个畜牧业过程。