第三节 吸光光度法
一、测定原理
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法、可见分光光度法及紫外分光光度法等。本章重点讨论可见光区的吸光光度法。
有些物质的溶液是有色的，例如
溶液呈紫红色，
水溶液呈橙色。许多物质的溶液本身是无色或浅色的，但它们与某些试剂发生反应后生成有色物质，例如
与
生成血红色配合物；
与邻二氮菲生成红色配合物。有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深。如果是通过与标准色阶比较颜色深浅的方法确定溶液中有色物质的含量，则称为目视比色法，如果是使用分光光度计，利用溶液对单色光的吸收程度确定物质含量，则称为分光光度法。
吸光光度法主要用于测定试样中的微量组分，具有以下特点：
(1)灵敏度高。常可不经富集用于测定质量分数为
～
。的微量组分，甚至可测定低至质量分数为
～
的痕量组分。通常所测试的浓度下限达
～
。
(2)准确度高。一般目视比色法的相对误差为5％～l0％，分光光度法为
2％～5％。
(3)应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用分光光度法进行测定。不仅用于测定微量组分，也能用于高含量组分的测定及配合物组成、化学平衡等的研究。如农业部门常用于品质分析、动植物生
理生化及土壤、植株等的测定。
(4)仪器简单，操作方便，快速。近年来，由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂的不断出现，以及化学计量学方法的应用，常常可以不经分离就能直接进行比色或分光光度测定。
（一）物质对光的选择性吸收
1．光的基本性质
光是一种电磁波，同时具有波动性和微粒性。光的传播，如光的折射、衍射、偏振和干涉等现象可用光的波动性来解释。描述波动性的重要参数是波长
、频率
，它们与光速c的关系是：
在真空介质中光速为2.9979
，约等于
还有一些现象，如光电效应、光的吸收和发射等，只能用光的微粒性才能说明，即把光看作是带有能量的微粒流。这种微粒称为光子或光量子，其能量E决定于光的频率。
式中E为光子的能量(J)；h为普朗克常数(6.626
)。
由式(10．2)可知，A越小，E越大，所以短波能量高，长波能量低。 我们将眼睛能够感觉到的那一小段的光称为可见光，它只是电磁波中的一个很小的波段(400～750 nm)，也就是我们日常所见的日光、白炽光，是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种不同色光组合而成的复合光(即由不同波长的光所组成的光)。理论上，将仅具有某一波长的光称为单色光，单色光由具有相同能量的光子所组成。由不同波长的光组成的光称为复合光。单色光其实只是一种理想的单色，实际上常含有少量其他波长的色光。各种单色光之间并无严格的界限，例如黄色与绿色之间就有各种不同色调的黄绿色。不仅七种单色光可以混合成白光，两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合也可得到白光。这两种单色光称为互补色，例如绿色光和紫色互补，黄色光和蓝色光互补等。
2．光吸收曲线
颜色是物质对不同波长光的吸收特性表现在人视觉上所产生的反映。一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。如果把不同颜色的物体放在暗处，什么颜色也看不到。当光束照射到物体上时，由于不同物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、折射的程度不同而呈现不同的颜色。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点(离子或分子)对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长的色光而让那些未被吸收的色光透射过去即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现的是它吸收光的互补色的颜色。例如，
当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液，测量每一波长下有色溶液对该波长光的吸收程度(吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该溶液的吸收曲线，亦称为吸收光谱。
（3）吸收光谱产生的原理
吸收光谱一般有原子吸收光谱和分子吸收光谱。原子吸收光谱是由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波产生跃迁而引起的。我们所讨论的溶液的吸光度，属于分子吸收，所产生的光谱为分子吸收光谱，是分子中的价电子在分子轨道间跃迁产生的。在分子中，除了电子相对于原子核的运动之外，还有原子核的相对运动，分子作为整体围绕其重心的转动、分子的平动，以及原子之间的相对振动和分子中基团间的内旋转运动。因此，在分子中，除了电子运动能E。原子的核能E小分子转动能E，和分子平动能E。外，还有原子间的相对振动能E。和基团间的内旋转能E。等。当不考虑各种运动之间的相互作用时，可近似地认为分子的总能量为：
由于在一般化学实验条件下，
不发生变化，
和
又比较小，所以一般只需考虑电子运动能量、振动能量和转动能量：
而这三种能量又都是量子化的，对应有一定的能级。 在同一电子能级内，分子的能量还因振动能量的不同而分成若干分级，称为振动能级。当分子处于某一电子能级中某一振动能级时，分子的能量还会因转动能量的不同再分为若干分级，称为转动能级。显然，电子能级的能量差
，振动能级的能量差
和转动能级的能量差
，间相对大小关系为：
当分子状态一定时，分子的总能量就是分子所处的电子能级、振动能级和转动能级的能量之和。
分子的转动能级能量差一般在0．005～0．05 eV，产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250～25
的远红外光，这种光谱称为转动光谱或远红外光谱。 分子的振动能级能量差一般在0．05～1 eV，需吸收波长约为25～1．25
的红外光才能产生跃迁。在分子振动时，同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，必然包括转动光谱，所以常称为振一转光谱。振一转光谱是一系列波长间隔很小的谱线，加上谱线变宽和仪器分辨率低的原因，观察到的是一个谱峰，或称吸收带。因此它是带状光谱，每一不同的吸收带对应于不同的振动跃迁。由于它所吸收的能量处于红外光区，所以常称为红外光谱。各种物质的分子对红外光的选择吸收与其分子结构密切相关，故红外吸收光谱可应用于分子结构的研究。
分子的电子能级能量差约1～20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为1．25～0．06
，主要在真空紫外到可见光区，相应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见光谱。通常，分子是处在电子能级基态的振动能级上，当用紫外、可见光照射分子时，价电子可以跃迁产生的吸收光谱，在电子能级变化的同时，不可避免地伴随分子振动和转动的能级变化。因此它包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。
（二）光的吸收的基本定律
1．朗伯一比耳定律
1760年，朗伯(Lamber)指出，当单色光通过浓度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与液层厚度b成正比。这种关系称为朗伯定律，数学表达式为：
1852年，比耳(Beer)指出，当单色光通过液层厚度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中吸光物质的浓度c成正比。这种关系称为比耳定律，数学表达式为：
如果同时考虑溶液浓度与液层厚度对光吸收程度的影响，即将朗伯定律与比耳定律结合起来，则可得：
该式称为朗伯一比耳定律的数学表达式。上述各式中
、
分别为人射光强度和透射光强度；b为光通过的液层厚度(cm)；c为吸光物质的浓度(
)；
，
和K均为比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。上式的物理意义为：当一束平行的单色光通过均匀的某吸收溶液时，溶液对光的吸收程度
等与吸光物质的浓度和光通过的液层厚度的乘积成正比。
由于式中的
等项表明了溶液对光的吸收程度，定义为吸光度，并用符号A表示；同时，
是透射光强度与入射光强度之比，表示了入射光透过溶液的程度，称为透光度(以％表示时为透光率)，以T表示，所以又可表示为
应用该定律时应注意：(1)朗伯一比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)；(2)该定律应用于单色光时，既适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；(3)吸光度具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。根据这一规律，可以进行多组分的测定及某些化学反应平衡常数的测定。这个性质对于理解吸光光度法的实验操作和应用都有着极其重要的意义。
2．吸光系数和摩尔吸光系数
式中的比例常数K值随c、b所用单位不同而不同，如果液层厚度b的单位为cm，浓度c的单位为
，K用以表示，n称为吸光系数，其单位是
，则(10．6)式写为：
A=abc (10．7)
如果液层厚度b的单位仍为cm，但浓度c的单位为
，则常数K用
表示，
称为摩尔吸光系数，其单位是
，此时(10．6)写为：
A=
bc
吸光系数a和摩尔吸光系数
是吸光物质在一定条件、一定波长和溶剂情况下的特征常数。同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有不同的
值，同一化合物在不同波长处的
也可能不同，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以
一表示。
值越大，表示该有色物质对入射光的吸收能力越强，显色反应越灵敏。所以，可根据不同显色剂与待测组分形成有色化合物的
值的大小，比较它们对测定该组分的灵敏度。以前曾认为
>1×
的反应即为灵敏反应，随着近代高灵敏显色反应体系的不断开发，现在，通常认为
≥6×
的显色反应才属灵敏反应，
<2×
已属于不灵敏的显色反应。目前已有许多
≥1.0×
的高灵敏显色反应可供选择。
应该指出的是，
值仅在数值上等于浓度为1
，液层厚度为1 cm时有色溶液的吸光度，在分析实践中不可能直接取浓度为1
的有色溶液测定
值，而是根据低浓度时的吸光度，通过计算求得。
还应指出的是，上例求得的
值是把待测组分看做完全转变为有色化合物计算的。实际上，溶液中的有色物质浓度常因副反应和显色反应平衡的存在，并不完全符合这种化学计量关系，因此，求得的摩尔吸光系数称为表观摩尔吸光系数。
（三）比色法和吸光光度法及其仪器
1．目视比色法
用眼睛观察、比较溶液颜色深浅以确定物质含量的分析方法称为目视比色法。常用的目视比色法采用标准系列法，这种方法是使用一套由同种材料制成、大小形状相同的平底玻璃管(称为比色管)，分别加入一系列不同量的标准溶液和待测溶液，在实验条件相同的情况下，再加入等量的显色剂和其他试剂，稀释至一定刻度，然后从管El垂直向下观察，比较待测溶液与标准溶液颜色的深浅。若待测液与某一标准溶液颜色一致，则说明两者浓度相等；若待测液颜色介于两标准溶液之间，则取其算术平均值作为待测液的浓度。
目视比色法的主要缺点是准确度不高，如果待测液中存在第二种有色物质，就无法进行测定。另外，由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列不能久存，经常需在测定时配制，比较麻烦。虽然可采用某些稳定的有色物质(如重铬酸钾、硫酸铜和硫酸钴等)配制永久性标准系列，或利用有色塑料、有色玻璃制成永久色阶，但由于它们的颜色与试液的颜色往往有差异，也需要进行校正。
目视比色法的优点是仪器简单，操作简便，适用于大批试样的分析，灵敏度较高。因为是在复合光——白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯一比耳定律时，仍可用该法进行测定。因而它广泛用于准确度要求不高的常规分析中，例如土壤和植株中氮、磷、钾的速测等。
2．吸光光度法
（1）方法原理 吸光光度法是借助分光光度计测定溶液的吸光度，根据朗伯一比耳定律确定物质溶液的浓度。吸光光度法与目视比色法在原理上并不完全一样，吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过光的强度。例如，测定溶液中
的含量时，吸光光度法测量的是
溶液对黄绿色光的吸收情况，目视比色法则是比较
溶液透过红紫色光的强度。
（2）测定方法
①比较法。比较法是先配制与被测试液浓度相近的标准溶液
、被测试液
，在相同条件下显色后，测其相应的吸光度为A。和A。，根据朗伯一比耳定律：
两式相比得：
则得：
应当注意，进行计算时，只有当
与
相近时，结果才可靠，否则将有较大误差。
(2)标准曲线法。借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制标准曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准曲线上查得被测物质的浓度或含量。当测试样品较多时，利用标准曲线法比较方便，而且误差较小。
吸光光度法的特点是：因人射光是纯度较高的单色光，故使偏离朗伯一比耳定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大，分析结果的准确度较高。因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光度的加和性，可同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光的波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰，都可以用吸光光度法进行测定。
3．分光光度计及其基本部分
分光光度计一般按工作波长范围分类，紫外、可见分光光度计主要应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光束和双光束两类。
分光光度计通常由下列五个基本部件组成：
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显示仪表或记录仪
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样品室
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检测器
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单色器
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光源
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（1）光源 一般采用钨灯(350～800 nm,可见光用)和氘灯(190～400 nm，紫外光用)，根据不同波长的要求选择使用。要求光源有一定的强度且稳定。光源的作用是提供分析所需的复合光。
（2）单色器其作用是将光源发出的复合光分解为按波长顺序排列的单色光，并能通过出射狭缝分离出某一波长单色光。它由人射和出射狭缝、反射镜和色散元件组成，其关键部分是色散元件。常用的色散元件有棱镜和衍射光栅。
①棱镜。由玻璃或石英玻璃制成。玻璃棱镜用于可见光区，石英棱镜用于紫外和可见光区。复合光通过棱镜时，由于棱镜材料对不同波长光的折射率不同而产生折射。对一般的棱镜材料，在紫外一可见光区内，折射率与波长之间的关系可用科希经验公式表示：
式中N为波长为A的入射光的折射率，A、B、C均为常数。所以，当复合光通过棱镜的两个界面发生两次折射，根据折射定律，波长小的偏向角大，波长大的偏向角小，故而能将复合光色散成不同波长的单色光。
②光栅。光栅有多种，光谱仪中多采用平面闪耀光栅。它由高度抛光的表面(如铝)上刻画许多根平行线槽而成，一般为600条／mm、1 200条／mm，多的可达2
400条／nm，甚至更多。当复合光照射到光栅上时，光栅的每条刻线都产生衍射作用，而每条刻线所衍射的光又会互相干涉而产生干涉条纹。光栅正是利用不同波长的入射光产生的干涉条纹的衍射角不同，波长长的衍射角大，波长短的衍射角小，从而使复合光色散成按波长顺序排列的单色光。
（3）样品室样品室包括吸收池架和吸收池。吸收池(又称比色皿)由玻璃或石英玻璃制成，用于盛放试液。有不同厚度规格的吸收池。玻璃吸收池只能用于可见光区，而石英池既可用于可见光区，亦可用于紫外光区。使用时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。
(4)检测器检测器是一种光电转换元件，其作用是将透过吸收池的光信号强度变成可测量的电信号强度进行测量。目前，在可见一紫外分光光度计中多用光电管和光电倍增管。
光电管是一个真空二极管，阳极为一金属丝，阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质。根据光敏物质的性能不同，有红敏和紫敏两种。红敏光电管阴极表面涂有银和氧化铯，适用波长范围为625～1 000 nm；紫敏光电管是阴极表面涂有锑和铯，适用波长为200--625 nm。
光电倍增管是利用二次电子发射放大光电流的一种真空光敏器件。它由一个光电发射阴极，一个阳极以及若干级倍增极所组成。
(5)显示仪表和记录仪早期的分光光度计多采用检流计、微安表作显示装置，直接读出吸光度或透光率。近代的分光光度计则多采用数字电压表等显示和用X—Y记录仪直接绘出吸收(或透射)曲线，并配有计算机数据处理台。
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