质粒载体

质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。

编辑本段 质粒的基本特征

质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：

编辑本段 是染色质外的双链共价闭合环形DNA

（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，<15kb的小质粒比较容易分离纯化，>15kb的大质粒则不易提取。

能自主复制，是能独立复制的复制子

（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中，随宿主DNA复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，也能整合入细菌的DNA，又能从细菌染色质DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。

质粒对宿主生存并不是必需的

这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。医学上遇到许多细菌的抗药性，常与R质粒在细菌间的传播有关，F质粒就能促使这种传递。

现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。图20-2给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG和Xgal时，lacz ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacz '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacz '编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。

除常用的大肠杆菌质粒载体外，近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体（shuttle vectors）。

编辑本段 质粒的分类

按复制形式

分为严紧型和松弛型复制。

按基因转移性

分两类：（1）传递性质粒：常为大型、严紧型质粒；

（2）非传递性质粒：多为小型、松弛型质粒。

按遗传性状、产物分类

（1）抗生素抗性：如氨苄西林、氯霉素抗性；

（2）限制酶-修饰酶（R-M）系统：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。

编辑本段 人工构建的质粒载体分类

高拷贝数的质粒载体

ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。

低拷贝数的质粒载体

由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。

失控的质粒载体

这是一类温度敏感型复制控制质粒。如pBEU1、 pBEU2。

插入失活型克隆载体。载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42。

正选择的质粒载体

直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

编辑本段 质粒载体的筛选特征

选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。

所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。

选择性标志：编码抗生素抗性的基因对质粒载体来说是最普遍的细菌选择性标志（如pBR322）；主要的抗生素选择基因有：氨苄青霉素，氯霉素，四环素和卡那霉素四种。转化的宿主菌一般都是抗生素敏感型的，获得质粒后，它能在有抗生素的平板上生长，从而达到筛选的要求。另一个显性的选择标志就是对λ噬菌体感染的免疫（也就是λ阻抑物）。有时也会用的一些隐性标志，如leuB-（亮氨酸存在时就不能生长）。

编辑本段 多克隆位点

如今的载体都含有一多克隆位点（Multiple cloning site, MCS）或多位点接头[包含约20个串联排列的限制性内切核酸酶位点（如pUC19）]这些位点在载体内通常是独一无二的，这样就可以防止插入片段插入不恰当的位置，如载体其他的特征导致破裂的位点。多克隆位点的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段，可以针对插入片段提供特定的酶切位点图谱，在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。在选择质粒载体时既要考虑在多接头处出现的是何位点，又要考虑到这个位点的顺序，因为必须确保特定的位点存在于多接头里。