Protein Data Bank的十万多个蛋白质结构数据中，约有90%是由X射线单晶体衍射分析提供的。但是，仍然有许多重要的蛋白质不能或者很难制成适于做X射线衍射实验的单晶体
XFEL相关的衍射分析
硬X射线自由电子激光用于物质结构的衍射分析，有一个意义重大的目标，就是要实现原子分辨率（～1Å）的X射线相干 衍射成像（CDI），也叫做"没有晶体的晶体学（Crystallography without crystals）"。这里的晶体学，指的是X射线晶体学。 它在二十世纪的科技发展中有极为重要的推动作用。1912年德国的M. von Laue发现了晶体对X射线的衍射效应。1914年他为此 获得诺贝尔物理奖。英国的Bragg父子（W. H. Bragg和W. L. Bragg）在此基础上创立了X射线晶体学。他们在1915年为此获得 诺贝尔物理奖。自上世纪初开始，X射线晶体学开启了人类在原子尺度下研究晶态物质内部结构的历史。它促使凝聚态物理学、 结构化学、材料科学、生命科学等等发生了根本性的变化。其影响遍及人类社会的许多方面。仅以生物学为例：根据一系列氨基 酸、简单肽的X射线结构分析，L. C. Pauling导出了蛋白质分子中多肽链的α-螺旋和β-折叠构型（1954 诺贝尔化学 奖）；基于R. E. Franklin所拍摄DNA的X射线衍射图，J. D. Watson和F. H. C. Crick"猜"出了核酸的双螺旋结构并揭示了它在 生命物质中传递信息的重要意义（1962 诺贝尔生理学或医学奖）；M. F. Perutz和 J. C. Kendrew等人用X射线单晶体衍射方法 测定了肌红和血红蛋白的三维结构(1964诺贝尔化学奖)。这些里程碑式的成果揭开了结构生物学的序幕。其后对大量蛋白质的结 构分析，使得在基础研究方面对生命过程的了解深入到原子或分子的层次；在工业应用方面发展出崭新的药物设计技术。结构已 被测定并存入国际蛋白质数据库Protein Data Bank（PDB）的蛋白质数目，到2014年就超过了十万个。这些结构数据89%来自单 晶体的X射线衍射分析，10%来自核磁共振（NMR）研究，1%来自电子显微学。和其他研究手段相比，X射线晶体学占有难以撼动的 主导地位。鉴于晶体学，尤其是X射线晶体学的巨大贡献，联合国将2014年（M. von Laue因发现X射线衍射效应而获得诺贝尔奖 100周年）定为国际晶体学年（http://iycr2014.org）。
一、没有晶体的晶体学
"没有晶体的（X射线）晶体学"就是要将X射线衍射分析方法推广应用于不具备周期性的凝聚态物质。实现了这个目标，就意味着 X射线衍射分析方法可以覆盖整个凝聚态领域。这是一个比晶态物质广阔得多的领域。因此，"没有晶体的晶体学"将会产生远大 于X射线晶体学迄今已经产生的影响。
"没有晶体的晶体学"，其源头是 60多年前一篇只有半页纸的文章 [1] 。它提出X射线 衍射的相位问题可以通过在倒易空间用比Bragg衍射高出2D倍（D是衍射图的维数，它等于2或者3）的密度进行抽样而解决。这种 方法的应用尤其适合于不具备周期性的凝聚态物质。经过多年的后续发展，一个将X射线衍射分析方法推广用于不具备周期性的 凝聚态物质的研究方向逐步形成，这就是X射线的相干衍射成像（CDI）[2] 。其中用于衍射相位推演的方法即所谓"过采样 相位推演（over sampling phasing）"法[3] 。酵母单细胞的二维X射线相干衍射成像，是X射线 CDI用于生物试样的一个成功例子[4]。虽然只是一幅二维的 图像，虽然分辨率只有30纳米，但是，相对于其它技术，X射线CDI有更好的发展前景。酵母单细胞代表了一大类需要做结构分析 的试样，对它们进行整体的、未经损伤的结构分析，有不言而喻的重要意义。这类试样的复杂程度以及不易结晶，使常规的X 射线晶体学方法难以插足；它们两、三个微米或者更大的厚度，又使基于电子衍射效应的高分辨电子显微学方法（例如Cryo-EM） 望而却步。因此，要研究大量不具备周期性的凝聚态物质在原子尺度下的内部结构，发展原子分辨率的X射线CDI是重中之重。
二、"先衍射，后损伤"的数据采集方法
要大幅度提高X射线CDI的分辨率，首先要解决的问题有两个：一个是X光源的强度需要极大地提高以保证非晶态物质的高分辨衍射 图有足够的信噪比；另一个是必须有办法避免辐照损伤对衍射过程的干扰，否则再强的光源也起不了作用。硬X射线自由电子激光 （HXFEL）是当前及今后相当长的时间内可用的最强X光源。实际上，原子分辨率的X射线CDI本身就是HXFEL发展的重要推动力之一 。虽然目前国际上HXFEL的单脉冲光子数还没有达到原子分辨率X射线CDI的要求，但是，HXEEL已经成为发展原子分辨率X射线CDI 所不可缺少的基础。当年在D. Sayre（他已于2012年去世）领导下长期从事X射线CDI研究的H. N. Chapman，如今已是一位世界级 的领军人物。他正在领导德国自由电子激光中心（CFEL）的相干成像分部（coherent imagine division）。这是一个从事X射线 CDI研究的、四十多人的团队。
相对于强X光源，解决辐照损伤问题的进展则较为顺利。2000年瑞典J. Hajdu小组通过理论分析和模拟计算，提出使用超短（时长 <10飞秒）的X光脉冲，可以在试样被破坏之前记录其衍射图[5]。2006年H. N. Chapman等人用软X 射线激光做试验，证实了 J. Hajdu等人的设想[6]。2011年Chapman等人在世界上第一个HXFEL装 置LCLS(Linac Coherent Light Source)上用大量0.2～2微米的膜蛋白光合体系I（photosystem I）微晶颗粒，用符合"先衍射， 后损伤"原理的实验装置，采集了三百多万张衍射快照（diffraction snapshots）。最后整合成一套8.5Å分辨率的单晶体衍射 数据。经过检验，这套数据符合单晶体结构分析的要求[7]。H. N. Chapman在LCLS做实验使用的装置 包含了实现"先衍射，后损伤"的一套综合技术，这就是由德国CFEL为第四代光源建造的多功能实验装置[8]以及由美国亚利桑那州立大学开发的用于输送微粒或微晶试样 的喷流技术[9]。这一整套技术本来是为提高X射线CDI的分辨率而发展起来的。用于晶态物质的衍射分析，并非它的终极目标。 但是这种技术已经使X射线晶体学进入了一个将要产生巨大变革的时期。
三、串行晶体学
"串行晶体学"源出于2011年Chapman的实验[7]以及稍后S. Boutet等人在LCLS采集1.9Å分辨率溶菌酶晶体衍射数据的工作 [10]。当时称为"串行飞秒晶体学（Serial Femtosecond Crystallography, 缩写为SFX）"。其中"串行"指的是试样中的大量微晶颗粒以串行的方式顺序地单独和X射线相遇、衍射、然后损坏。"飞秒"指所用光源是脉冲长度只有 几个到几十个飞秒的硬X射线激光。"晶体学"指的是"X射线晶体学"或者更确切地说，应该是"X射线衍射分析"。2014年至今有一 系列研究报道，证明对于结晶状态的颗粒试样，利用现有的三代同步辐射光源，照样可以实现"先衍射，后损伤"的数据采集方式 [11-14]。这样，"串行飞秒晶体学"就演变为"串行晶体学（Serial Crystallography，缩写为SX）"。后者既可以使用XFEL光源，也可以使用三代同步辐射光源。串行晶体学有两个特点：（1）先衍射，后损伤；（2）用大量微晶试样产生一套单晶衍射数据。这两个特点都是以前没有见过的。它们将会引发X射线晶体学的巨大变革，从而对相关的学科产生深刻的影响。
四、串行晶体学与结构生物学
测定蛋白质和其它生物大分子的晶体结构是结构生物学的重要实验基础。至今存入Protein Data Bank的十万多个蛋白质结构数据中，约有90%是由X射线单晶体衍射分析提供的。但是，仍然有许多重要的蛋白质不能或者很难制成适于做X射线衍射实验的单晶体。串行晶体学的出现，为用X射线研究生物大分子的结构提供了许多新的可能：（1）可以用微米甚至亚微米的多晶样品来测定蛋白质的结构，过去一般需要用比这大几十倍的单晶体。（2）可以在室温下进行衍射实验。过去样品一般都需要冷冻处理以 增加样品抗辐照的能力，但也增加了样品的镶嵌程度，甚至改变了蛋白质分子结构的细节。室温条件更便于操作，也更接近于 蛋白质的天然活动环境。（3）能够对生物体内形成的蛋白质微晶进行分析研究[15]，甚至不需要将这些微晶从生物细胞中取出来[16]。（4）还可以进行蛋白质结构的动态研究[17-20]。
另一方面，串行晶体学是问世不久的新事物。它本身还有一些关键问题需要解决；许多新的应用还有待开发。五年来，有 不少关于这方面工作的报道。当前，最大的问题是：由串行晶体学所得的单晶体衍射数据，其质量相较于由三代同步辐射的单晶 体衍射所得，还有一定差距。这除了影响分析结果的精度，还妨碍串行晶体学顺利地继承单晶体衍射分析中一些重要的相位推演 方法，例如利用异常散射或同晶型置换信息的方法。因此，如何在实验方案和数据处理方法上提高所得衍射数据的质量，应该是 今后的重点研究方向。已有一系列研究着眼于处理串行晶体学不能直接记录到完整的Bragg衍射点所带来的问题[21-25]。还有一些研究针对试样不均匀性的影响[25-28]。
五、串行晶体学与材料科学
串行晶体学可以用"多晶试样"产生"单晶衍射"。这使它对于材料科学的基础和应用研究都将产生革命性的影响。X射线衍射有 "单晶衍射"和"多晶衍射"之分。单晶衍射就是用一颗几十到几百微米大小的晶体单独产生衍射；多晶衍射则使用大量半个微米至 几微米，因而不适合做X射线单晶衍射的、随机取向的单晶体颗粒同时产生衍射。单晶衍射的结果是一个用衍射强度"加权"的三维倒易点阵；多晶衍射的结果则是一维的谱线，它是大量同心的、形状和大小相同但取向各异的加权三维倒易点阵叠加的结果。在材料科学中遇到的晶态物质，大部分以多晶的形式存在。因此多晶衍射在材料科学中的应用较之单晶衍射要广泛得多。但是， 多晶衍射对晶体结构的解析能力大约只有单晶衍射的百分之一。这一状况严重地影响了对多晶物质的深入研究。串行晶体学有 可能彻底改变这种状况。
五年来串行晶体学应用的发展是不平衡的。发表在国际著名刊物的、有关串行晶体学在材料科学上应用的研究论文至今只有3篇。 其中两篇是关于改进实验装置的，都和瑞士的 Paul Scherrer 研究所有关[29, 30]。文章报道了在瑞士SwissFEL建立一个带通为4%的XFEL工作模式，以便于对材料科学中的晶态物质进行研究。还有一篇是关于数据分析方法的，出自中科院物理所[31]。该文通过模拟计算表明：串行晶体学可以用一次实验，对未知的混合物多晶试样同时进行物相鉴定和结构 分析。这是现有的X射线多晶（粉晶）分析根本不可能做的事情，如果能够通过实例试验，无论对基础科研还是工业技术都会有 重要的应用价值。
六、回到高分辨X射线CDI
串行晶体学只是一个中间产物，高分辨X射线CDI则是更高的目标。当前由于光源的强度不够，暂时做不了实验。但是，方法研究 是可以先行的。高分辨X射线CDI，因为既没有合适的透镜，又无法记录衍射的相位，所以用计算方法去做相位推演就成了一个 关键的环节。已有的"过采样"方法，实际上是在衍射相位的"双空间迭代"过程中施加于"物理空间"的一个约束条件。这个约束 条件的有效分辨率范围大约在几百Å至10Å之间。我国对高分辨（1～5Å）衍射相位的双空间迭代以及用 "直接法"在倒易空间做相位约束，有一定的研究基础[32]。可以考虑把二者结合起来，形成一种新的、更有效的方法[33]。
[1] Sayre, D. (1952). "Some implications of a theorem due to Shannon". Acta Cryst. 5, 843.
[2] Sayre, D., Chapman, H. N. & Miao, J. (1998). "On the Extendibility of X-ray Crystallography to Noncrystals". Acta Cryst. A54, 232-239.
[3] Miao, J., Sayre, D & Chapman, H. N. (1998). "Phase retrieval from the magnitude of the Fourier transforms of nonperiodic objects". J. Opt. Soc. Am. A 15, 1662-1669.
[4] Shapiro, D., Thibault, P., Beetz, T., Elser, V., Howells, M., Jacobsen, C., Kirz, J., Lima, E., Miao, H., Neiman, A. M. & Sayre, D. (2005). "Biological imaging by soft x-ray diffraction microscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15343-15346.
[5] Neutze, R., Wouts, R. van der Spoel, D., Weckert, E. & Hajdu, J. (2000). "Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses".Nature 406, 752-757.
[6] Chapman, H. N. et al. (2006). "Femtosecond diffractive imaging with a soft-X-ray free-electron laser". Nature Physics 2, 839-843.
[7] Chapman, H. N. et al. (2011). "Femtosecond X-ray protein nanocrystallography". Nature, 470, 73-77.
[8] Strüder, L. et al., (2010). Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. A 614, 483-496.
[9] Spence, J. C. H. et al. (2004). Phys. Rev. Lett. 92, 198102; D. P. DePonte, et al. (2008). J. Phys. D 41, 195505.
[10] Boutet, S. et al. (2012). "High-Resolution Protein Structure Determination by Serial Femtosecond Crystallography". Science 337, 362-364.
[11] Gati, C. et al. (2014). "Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation". IUCrJ, 1, 87-94.
[12] Stellato, F. et al. (2014). "Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation". IUCrJ, 1, 204-212.
[13] Botha, S. et al. (2015). "Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams". Acta Cryst. D71, 387-397.
[14] Nogly, P. et al. (2015). "Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation". IUCrJ, 2, 168-176.
[15] Koopmann, R. et al. (2012). "In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology". Nature Methods 9, 259-262.
[16] Axford, D. et al. (2014). "In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin". Acta Cryst. D70, 1435-1441.
[17] Aquila, A. et al. (2012). "Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser". Opt. Express 20, 2706-2716.
[18] Neutze, R. & Moffat, K. (2012). "Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges".Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 651-659.
[19] Spence, J. C. H., Weierstall, U. & Chapman, H. N. (2012). "X -ray lasers for structural and dynamic biology". Rep. Prog. Phys. 75, 102601.
[20] Kupitz, C. et al. (2014). "Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser". Nature 513, 261-265.
[21] Brehm, W. & Diederichs, K. (2014). Acta Cryst. D70, 101-109.
[22] Kabsch, W. (2014). Acta Cryst. D70, 2204-2216.
[23] Hattne, J. et al. (2014). Nat. Methods, 11, 545-548.
[24] Zeldin, O. B., Brewster, A. S., Hattne, J., Uervirojnangkoorn, M., Lyubimov, A. Y., Zhou, Q., Zhao, M., Weis, W. I., Sauter, N. K. & Brunger, A. T. (2015). Acta Cryst. D71, 352-356.
[25] Sauter, N. K. (2015). "XFEL diffraction: developing p rocessing methods to optimize data quality". J. Synchrotron Rad. 22, 239-248.
[26] Zhang, T. et al. (2014). "Single-crystal diffraction data from powder samples via SFX". Abstract
and poster 
at 23rd IUCr Congress and general assembly, Montreal, Canada, August 5-12, 2014.
[27] Zhang, T. et al. (2015). "Serial crystallography analysis of protein isomorphous replacement data from a mixture of native and derivative(s) micro-crystals". (To be published in Acta Cryst. D).
[28] Zhang, T. et al. (2015). "Effects of sample impurities on serial crystallography SAD phasing". (In preperation).
[29] Dejoie，C. et al. "Using a non-monochromatic microbeam for serial snapshot crystallography". (2013). J. Appl. Cryst. 46, 791-794.
[30] Dejoie, C. et al. (2015). "Serial snapshot crystallography for materials science with SwissFEL". IUCrJ 2, 361-370.
[31] Zhang, T. et al. (2015). "SFX analysis of non-biological polycrystalline samples". IUCrJ 2, 322-326.
[32] Fan, H., Gu，Y., He, Y., Lin, Z., Wang, J. & Yao, D. (2014). "Applications of direct methods in protein crystallography for dealing with diffraction data down to 5Å resolution". Acta Cryst. A70, 239-247. Acta Cryst. D70, 2686-2691 (2014).
[33] Fan Hai-Fu, "Diffraction phasing for nano-crystals/particles". Lecture at the FEL (Free Electron Lasers) 2011 workshop, Shanghai, China, August 20-21, 2011.
[2] Sayre, D., Chapman, H. N. & Miao, J. (1998). "On the Extendibility of X-ray Crystallography to Noncrystals". Acta Cryst. A54, 232-239.
[3] Miao, J., Sayre, D & Chapman, H. N. (1998). "Phase retrieval from the magnitude of the Fourier transforms of nonperiodic objects". J. Opt. Soc. Am. A 15, 1662-1669.
[4] Shapiro, D., Thibault, P., Beetz, T., Elser, V., Howells, M., Jacobsen, C., Kirz, J., Lima, E., Miao, H., Neiman, A. M. & Sayre, D. (2005). "Biological imaging by soft x-ray diffraction microscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15343-15346.
[5] Neutze, R., Wouts, R. van der Spoel, D., Weckert, E. & Hajdu, J. (2000). "Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses".Nature 406, 752-757.
[6] Chapman, H. N. et al. (2006). "Femtosecond diffractive imaging with a soft-X-ray free-electron laser". Nature Physics 2, 839-843.
[7] Chapman, H. N. et al. (2011). "Femtosecond X-ray protein nanocrystallography". Nature, 470, 73-77.
[8] Strüder, L. et al., (2010). Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. A 614, 483-496.
[9] Spence, J. C. H. et al. (2004). Phys. Rev. Lett. 92, 198102; D. P. DePonte, et al. (2008). J. Phys. D 41, 195505.
[10] Boutet, S. et al. (2012). "High-Resolution Protein Structure Determination by Serial Femtosecond Crystallography". Science 337, 362-364.
[11] Gati, C. et al. (2014). "Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation". IUCrJ, 1, 87-94.
[12] Stellato, F. et al. (2014). "Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation". IUCrJ, 1, 204-212.
[13] Botha, S. et al. (2015). "Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams". Acta Cryst. D71, 387-397.
[14] Nogly, P. et al. (2015). "Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation". IUCrJ, 2, 168-176.
[15] Koopmann, R. et al. (2012). "In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology". Nature Methods 9, 259-262.
[16] Axford, D. et al. (2014). "In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin". Acta Cryst. D70, 1435-1441.
[17] Aquila, A. et al. (2012). "Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser". Opt. Express 20, 2706-2716.
[18] Neutze, R. & Moffat, K. (2012). "Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges".Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 651-659.
[19] Spence, J. C. H., Weierstall, U. & Chapman, H. N. (2012). "X -ray lasers for structural and dynamic biology". Rep. Prog. Phys. 75, 102601.
[20] Kupitz, C. et al. (2014). "Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser". Nature 513, 261-265.
[21] Brehm, W. & Diederichs, K. (2014). Acta Cryst. D70, 101-109.
[22] Kabsch, W. (2014). Acta Cryst. D70, 2204-2216.
[23] Hattne, J. et al. (2014). Nat. Methods, 11, 545-548.
[24] Zeldin, O. B., Brewster, A. S., Hattne, J., Uervirojnangkoorn, M., Lyubimov, A. Y., Zhou, Q., Zhao, M., Weis, W. I., Sauter, N. K. & Brunger, A. T. (2015). Acta Cryst. D71, 352-356.
[25] Sauter, N. K. (2015). "XFEL diffraction: developing p rocessing methods to optimize data quality". J. Synchrotron Rad. 22, 239-248.
[26] Zhang, T. et al. (2014). "Single-crystal diffraction data from powder samples via SFX". Abstract
and poster at 23rd IUCr Congress and general assembly, Montreal, Canada, August 5-12, 2014.[27] Zhang, T. et al. (2015). "Serial crystallography analysis of protein isomorphous replacement data from a mixture of native and derivative(s) micro-crystals". (To be published in Acta Cryst. D).
[28] Zhang, T. et al. (2015). "Effects of sample impurities on serial crystallography SAD phasing". (In preperation).
[29] Dejoie，C. et al. "Using a non-monochromatic microbeam for serial snapshot crystallography". (2013). J. Appl. Cryst. 46, 791-794.
[30] Dejoie, C. et al. (2015). "Serial snapshot crystallography for materials science with SwissFEL". IUCrJ 2, 361-370.
[31] Zhang, T. et al. (2015). "SFX analysis of non-biological polycrystalline samples". IUCrJ 2, 322-326.
[32] Fan, H., Gu，Y., He, Y., Lin, Z., Wang, J. & Yao, D. (2014). "Applications of direct methods in protein crystallography for dealing with diffraction data down to 5Å resolution". Acta Cryst. A70, 239-247. Acta Cryst. D70, 2686-2691 (2014).
[33] Fan Hai-Fu, "Diffraction phasing for nano-crystals/particles". Lecture at the FEL (Free Electron Lasers) 2011 workshop, Shanghai, China, August 20-21, 2011.
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