怎样理解“DNA”是生命的蓝图这句话？（二）
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怎样理解“DNA是生命的蓝图”这句话？（二）
我们的五根手指头是如何长出来的？
人手是动物进化的杰作之一。在人身上，上肢基本上从移动身体位置的功能脱离，变成我们从事各种工作的器官。特别是上肢的多节段构造，手指又有5根，而且拇指和其余4指的位置相对，使它成为人类极其有用的“自带工具”。我们不仅可以用手拿物（例如搬运物品），还用手拿的物品作为我们身体的延伸，进行各种活动，例如用勺或筷子吃饭、用牙刷刷牙、用毛巾洗脸、拿刀砍柴、拿锤敲钉子、拿改锥拧螺丝、拿剪刀剪东西、拿弓演奏弦乐器等。人的手还可以敲键盘打字，演奏钢琴和其它键盘乐器、打手势、还可以进行需要高精度的活动，例如按弦、写字、绘画、雕刻、绣花等。如果没有手，我们的生活内容就会大打折扣。
在日常生活中，我们把有手并且使用手当作是一件理所当然的事情，很少去想这样的结构是如何形成的。现在我们以动物的上肢（小鼠的上肢和鸡的翅膀）为例，来具体说明这样有用的结构是如何发育出来的。
在上一篇文章中，我们已经介绍了形成生物结构的“基本工具”。在介绍手是如何长出来的之前，我们还需要先了解一下这些基本工具中，扩散分子控制生物结构形成的理论。
第一节 扩散分子指导生物结构形成的相关理论
扩散性的分子可以在细胞间移动，在比较长的距离上起作用，影响大范围细胞的命运，这就突破了细胞之间通过直接接触来影响细胞命运的局限性，能够在器官的尺度上控制结构的形成，是胚胎发育高层的控制机制。但是在上个世纪90年代之前，科学家还不知道这些扩散性的分子，而只能根据一些胚胎发育的现象来推测这些扩散性分子的存在及其作用。例如德国科学家汉斯·斯佩曼（Hans Spemann）根据他在两栖动物胚胎发育的实验，于1924年提出了“斯佩曼组织中心”（Spemann’s organizer）的概念，认为是一些细胞团在控制生物身体发育。这些细胞团的作用，是分泌出扩散性的分子，在长距离上控制其它细胞的命运，让它们形成各种结构。1969年，英国科学家Lewis Wolpert提出了“法国国旗学说”（Franch flag theory）。这个学说的内容和斯佩曼组织中心的想法类似，也是通过扩散分子的作用，影响远距离细胞的命运。无独有偶，这个由扩散分子控制结构形成的想法还曾经由一位非生物学家，而是数学家提出来，这就是英国科学家阿兰·图灵（Alan Mathison Turing)，他于1925年提出了“图灵学说”（Turning’s Theory of morphogenesis）。
在没有具体的扩散分子被鉴定出来的情况下，提出扩散分子控制结构形成的想法，在当时是非常超前和具有天才眼光的。随着科学研究的进展，具体的扩散性分子一个接一个地被发现和鉴定，证实了这些先驱科学家的预见。对生物器官形成过程的研究表明，上面提到的这些学说都是正确的，都在生物结构的形成中起作用。下面我们就具体介绍这些学说的内容。
斯佩曼组织中心（Spemann’s Organizer）
德国科学家汉斯·斯佩曼（Hans Spemann，1869-1941）是动物克隆的先驱人物。1903年，他用婴儿（他的小女儿）的头发做成套索，成功地把2细胞阶段蝾螈胚胎中的两个细胞分开，并且让它们分别长成一只蝾螈。他进一步提出把动物胚胎细胞里面的细胞核转移到去核卵细胞中形成胚胎的想法，并且亲自从事两栖类动物细胞核转移的试验，于1928年取得成功。这个方法后来成为克隆动物的主要方法，例如克隆羊“多利”（Dolly）就是这样产生的。因此斯佩曼是当之无愧的动物克隆理念和技术的开创者。由于他在胚胎学和动物克隆上的杰出贡献，斯佩曼在1935年被授予诺贝尔生理或医学奖。
斯佩曼的贡献还不止如此，他还把囊胚期（blastula）的非洲爪蟾（African clawed frog, Xenopus Laevis）胚胎分割成两半，如果每一半都含有“原口背唇“（blastopore dorsal lip）部分，那么每一半都能够长成一个完整的胚胎，只是比完整囊胚长成的胚胎小一些。这个结果说明，原口背唇部分的细胞具有控制胚胎结构形成的能力，即控制远处细胞分化和形成结构的能力，而这很可能是通过这个区域的细胞分泌出可扩散分子来实现的。1918年，美国科学家哈瑞森（Ross Harrison）做了另一个有趣的实验。他把蝾螈胚胎要长前肢处的细胞团切下来，移植到另一个蝾螈胚胎的两侧，结果在移植细胞团的地方也长出了前肢。这说明和原口背唇一样，这些原肢细胞团也能够控制前肢的形成。斯佩曼把这种能够控制胚胎发育的细胞团叫做“斯佩曼组织中心”（Spemann’s organizer），它能够通过分泌可扩散分子影响其它细胞的命运。但是在长时期中，这些分泌的分子究竟是什么，没有人知道。
1991年，美国科学家罗伯茨（Edward M. De Roberts）从蝾螈原口背唇细胞中，克隆到了一个叫做“goosecoid”的基因，简称Gsc基因，其表达的mRNA清楚地划分出组织中心的边界范围。把Gsc基因的mRNA注射到非洲爪蟾胚胎的腹部区域，能够使胚胎发展出两个对称轴，这说明它很可能与组织中心的功能有关。但是Gsc基因的产物是一个转录因子，能够结合在DNA上，影响其它基因的转录，但本身并不是一个被细胞分泌的分子。这说明Gsc基因应该能够促使某些分泌分子基因的表达，是这些分泌到细胞外的基因产物影响长距离上其它细胞的命运。
1992年，美国科学家Richard Harland克隆到组织中心分泌的扩散分子，叫做“脑袋”（noggin），因为注射noggin基因的mRNA到蛙胚中会导致头部的过度发育。Noggin基因的产物就是一个分泌到细胞外的蛋白分子。1994年，另一个从组织中心分泌的蛋白分子的基因被克隆，被称为“follistatin”。它和noggin一样，也能诱导神经系统的发育。
随后的研究发现，除了原口背唇，蝾螈的胚胎还含有一个腹面的组织中心。这个组织中心和原口背唇一样，也分泌若干扩散性的分子，而且这两个中心都分泌骨形态发生蛋白BMP和它们的拮抗物，以及Wnt基因的拮抗物。因此，组织中心分别分泌多种信号分子，有的直接控制其它细胞命运，有的是这些分子的拮抗物。通过它们之间复杂的相互作用，共同控制身体各处细胞的命运。到目前为止，在原口背唇中克隆到的扩散性分子有：Adamp（anti-dorsalizing morphogenic protein，是一种BMP分子）、chordin、Noggin、Follistatin、Frzb1、sFrp2、Crescent、Dickkopt-1、Cerberus。其中chordin、Noggin、Follistatin是BMP的拮抗物，Frzb1、sFrp2、Crescent、Dickkopt-1是Wnt的拮抗物。
被腹面组织中心中分泌的扩散分子有：Bmp4、Bmp7、Cv2、Sizzled、Bambi、Xlr、Tsg。其中Xlr可以切断原口背唇分泌的chordin，使其丧失作用。因此，组织中心控制远程细胞命运的实际机制是非常复杂的，是通过一系列扩散性分子的协同作用和拮抗作用来实现的。“法国国旗学说”（Franch flag theory）
1969年，生于南非的英国科学家Lewis Wolpert (1929-)，在意大利的Bellagio举行的国际生物科学联合会第三次会议（International Union of Biological Sciences’ Third Serbelloni Meeting）上提出了“位置信息”的概念。他认为某些基因的产物能够在生物体中形成浓度梯度。由于在胚胎的不同地方这些分子的浓度不同，细胞就可以根据自己接触到的浓度判断自己在胚胎中的位置，并且因此决定自己的命运。例如高浓度的地区形成细胞类型A，用红色表示，中浓度的地方形成细胞类型B，用白色表示，低浓度的地方形成细胞类型C，用蓝色表示。红和白交界处就是决定细胞是变成A类型还是B类型的阈值，而白和蓝交界处的浓度就是决定细胞是变成B类型还是C类型的阈值。这种红-白-蓝的不同区域拼在一起，正好像一面法国国旗，所以这种理论就叫做“法国国旗理论”（Franch Flag Theory）。
在当时，这是一个革命性的概念，一开始受到许多同行的抵制。第2年，即1970年，发现DNA双螺旋的克里克（Francis Crick）发表了“胚胎发育过程中的扩散过程”（Diffusion in Embryogenesis）一文，支持了Wolpert的想法，并且提出了扩散分子可以通过从分泌位置向胚胎的其它地方扩散，形成浓度梯度的想法。这些扩散分子能够指导其它细胞向特定的方向发展，因此叫做“成型素”（morphogen）。
1988年，德国科学家Christiane Nüsslein-Volhard（1942-）在果蝇中提取到了第一个成型素Bicoid。Bicoid基因的突变会造成果蝇胚胎头部缺失，变成腹部的结构，使得果蝇有两个后端。研究发现，bicoid基因的mRNA和蛋白质都主要位于果蝇胚胎的前端，其浓度在前端最高，在向尾端的方向浓度逐渐降低。如果把bicoid的mRNA注射到果蝇胚胎的其它地方，则会在注射的位置长出头咽部的结构来，尾端的结构则向后移动。这说明bicoid基因的产物是决定果蝇前-后轴方向的决定性基因，这就证实了Wolpert 关于扩散分子的浓度梯度决定细胞命运的想法
为什么bicoid的mRNA会集中在胚胎的前端呢？这是因为这些mRNA是由母亲身体中，卵细胞前端的细胞合成的。这些mRNA进入卵细胞，与卵细胞内的微管（microtubule）结合，使它们不能进一步扩散到卵细胞的其它地方去。卵细胞受精后，这些mRNA就会被转译成为bocoid蛋白质，也集中在细胞的前端。
随后的研究发现，bicoid并不是果蝇卵细胞里面唯一的成型素。另一个成型素基因，叫“nanos”的mRNA，位于卵细胞的后部。另外两种mRNA，hunchback和caudal 的mRNA，则在卵细胞中均匀分布。在卵细胞受精后，bicoid和nanos的mRNA分子都被转译成为蛋白质，分别位于受精卵的两端，形成一个浓度梯度。由于bicoid的蛋白能够抑制caudal mRNA的转译，使得caudal蛋白质的浓度在前端低，后端高。Nanos的蛋白质又能够结合在hunchback的mRNA上，抑制它的转译，使得hunchback蛋白质的浓度前端高，后端低。这样，在果蝇的受精卵前端，bicoid和hunchback蛋白质的浓度高，它们活化果蝇为前部结构所需的基因，形成头胸部的结构。而在受精卵的后端，caudal和nanos蛋白质的浓度较高，它们活化后端结构所需的基因，形成后端的结构。因此，果蝇胚胎的发育是由多种成型素分子来控制的。
在这些研究的基础上，法国国旗理论的内容就可以被扩充。生物体结构的形成不仅是由一种成型素的浓度梯度决定的，而是不同的成型素在胚胎的两端分别形成浓度梯度，共同控制其间细胞的命运。身体不同位置的细胞不仅可以根据一种成型素的浓度，而且可以通过多种成型素的浓度来感知自己在胚胎中的位置，从而决定自己的命运，即向什么类型的细胞分化并且形成结构。法国国旗中的红-白-蓝也不仅是表示同一种成型素的不同浓度，而可以代表不同的成型素和它们的交叉位置。例如国旗中红色的区域可以代表果蝇中bicoid的高浓度区，蓝色代表nanos蛋白的高浓度区，中间的白色则代表两种成型素的交叉区。
在分子水平上，法国国旗理论和Spemann的组织中心其实是一回事，都是通过扩散分子建立的浓度梯度来给细胞以位置上的信息，只是最初提出这些理论时的出发点不同，一个是从特殊细胞团的组织能力出发，一个是从分子浓度梯度出发。是对成型素分子的具体研究把这两种学说统一在一起。
图灵学说
生物的一些结构常常使人感到神奇，例如斑马和斑马鱼身上的条纹、豹子身上的斑点、皮肤表面的毛发等等，都显现出一定的周期性，如斑马条纹明暗相间，皮肤上长毛发和不长毛发的地方交替出现等等。就是人的手指和脚趾也有周期性，在要形成手和脚的胚芽中出现周期性的成骨-不成骨的间隔分布，后来不成骨的区域消失，才形了手指和脚趾。这样周期性结构的形成机制是什么？要靠基因来直接控制是不行的，例如人的头发有十几万根，要靠区区两万多个基因来“规定”每根头发的位置，是根本不可能的事，应该有其他的机制来“自发”形成这样的周期性结构。但是在长时期中，这样的机制一直没有人知道。直到1952年，英国科学家阿兰·图灵（Alan Mathison Turing, 1912 – 1954)发表了他开创性的“结构形成的化学基础”（The chemical basis of morphogenesis）文章后，才给生物斑纹的形成提供了一个理论解释。
图灵是一个传奇性人物，在其短短的一生中做出了好几项重大贡献。他创造的“图灵机”被认为是计算机的鼻祖。在第二次世界大战期间，他协助军方破译德国的密码系统Enigma，为战争的提前结束做出了不可磨灭的贡献。他也对生物学感兴趣，在他生命的最后几年中，他致力于研究生物斑纹的形成机制，并且天才地提出了他的“反应-扩散学说”（reaction-diffusion equations）来解释扩散性的分子如何导致周期性结构的形成，并且预期了化学震荡反应的存在。按照Turning的发音，在中文中应该译成“图宁”才对。但是由于他的学说天才性地解释了生物斑纹形成的化学机制，也就是他的理论在说明“图像”形成时是很“灵”的，于是人们更愿意用“图灵”这个译法，我们在本文中也采用这个译法。图灵学说的核心是“反应-扩散”，即两种扩散分子如果能够相互作用，它们又以不同的速度在介质中扩散，就可以自发形成周期性的结构。
图灵学说依据的也是扩散性分子，因此和前面谈到Spemann组织中心和Wolpert的法国国旗理论是相通的，只是这些扩散性分子的作用机制有些不同。图灵描述的是一个非平衡系统，牵涉到分子扩散。其实Spemann组织中心和Wolpert的法国国旗理论都需要成型素的浓度梯度，因此也是非平衡系统。只不过图灵是从数学的角度来描述斑纹图像的形成机制，用到比较复杂的数学公式，许多读者不是那么容易理解，因此我们在这里只给出一个非数学的形象描述。
例如分子A可以促使自身的表达，即A分子可以增加自己基因的转录，这就是一个正反馈回路。如果只有A分子存在，那么最后在所有的区域内都有高浓度的A分子表达。但是如果A分子可以促使B分子的形成，而B分子可以对A分子产生抑制作用，而且扩散的速度比A分子快，就会在周边区域逐渐减少A分子的表达。许多这样的中心——周边区域组合在一起，就是豹子皮肤上斑点的图案，即A在自我强化中心的高浓度和周围被B分子抑制导致的A的低浓度周期性地彼此相间。
一个形象的比喻就是干燥草原上的蝗虫。如果干草在太阳底下温度越来越高，达到燃烧温度，就会出现许多起火点。燃烧的火会使更多的干草起火，形成正反馈，使火的范围越来越大，相当于只有分子A的正反馈。如果没有一个抑制火的机制，整个草原都会着火。如果在着火的地方有蝗虫，这些蝗虫就会跳开以免被火烧着，如果这些跳开的蝗虫又能够出汗或撒尿（当然这只是一个比喻），把干草弄湿，这些地方的草就不会着火。由于蝗虫跳开的速度比火蔓延的速度快，每个火点周围就会有一圈不会着火的地方。蝗虫的“汗”或“尿”就相当于抑制A分子的B分子。这样，草原上起火的地方就不是连成一片的，而是彼此分开成点状的。这些着火的区域，就相当于豹子身上的斑点。
在这里，斑点之间的距离就是图像的周期，取决于具体的反应扩散分子的性质和它们扩散的速度。如果能够改变其中一些参数，周期就可以被增长或者缩短。如果分子A的浓度又可以决定细胞的命运，像前面谈到的成型素分子那样，那么在A浓度不同的地方就会形成不同类型的细胞，例如皮肤上的毛囊。斑马身上的条纹距离很近，而大熊猫黑白区域的分隔很大，就是因为形成这些图案时的周期大小不同的缘故。
图灵学说首先被化学家所证实。2014年，美国科学家Seth Fraden和Irv Epstein 用他们构建的化学反应系统，成功地产生了环状的结构，而且图像就如图灵当初预期的那样。图灵对化学震荡的预期也被化学家所证实，例如著名的“别洛乌索夫-扎博京斯基反应”（Belousov– Zhabotinsky reaction）。在这个反应中，四价的铈（Cerium）与溴酸钾、柠檬酸、硫酸、水混合在一起。按照一般的预期，四价的铈被还原成为三价的铈时，四价铈离子的黄色应该消失，但是别洛乌索夫和扎博京斯基观察到的，却是溶液在黄色和无色的状态之间反复震荡，证实了图灵的预期。
在生物体系中，图灵学说的计算机模拟很好地再现了动物体表的各种斑纹图案，说明在理论上，这样的机制是可以在生物系统中“自发”形成各种斑纹和结构的。但是找到具体操作的分子却不容易。这是因为胚胎的发育是动态的，许多成型素基因的突变又是致命的。这个情形在2014年改变了。西班牙的科学家成功在小鼠五趾的形成过程中证实了图灵理论的正确性，找到了相当于分子A和B的正反馈-负反馈扩散性分子。这些分子也正好是我们前面介绍过的骨形态发生蛋白BMP和Wnt蛋白。下面我们将详细地叙述这个过程
第二节四肢动物的肢体是如何形成的？
从外面来观察动物的身体结构，基本上可以分为头、颈、躯干、和四肢这几个部分，有些动物还有尾巴。其中四肢是负责运动的。没有四肢，动物就不能成为“动”物。动物的四肢分为一对前肢和一对后肢。它们基本上都由三个部分组成，分别是靠近躯干部分的节段（英文叫Stylopod，我们将其称为“近段”），中间区段（英文叫zeugopod，我们将其称为“中段”）和离躯干最远的手脚掌部分（包括腕或踝、掌、及指或趾，英文叫autopod，我们将其称为“掌段”）。近段和中段本身都不能弯曲，靠它们之间的关节改变彼此的相对位置。掌段部分也和中间区段以关节相连，因此无论是前肢还是后肢，这三个部分的相对位置都能够变化，以适应运动的需要。掌段部分又分为几个部分，分别是腕（踝）、掌、和趾。它们之间也以关节相连，所以也可以改变相对位置，比近段和中段有更大的灵活性。到了人类，由于直立行走的缘故，前肢变成为上肢（也叫手臂，包括上臂、前臂、手掌），后肢变为下肢（也叫腿，包括大腿、小腿和脚掌）。如果我们考察支撑肢体各部分的骨头，也可以发现一个规律，就是这些骨头的数量和位置在不同的动物中是彼此对应的。以人为例，近段（上臂或大腿）只由一根骨头支撑，在上肢为肱骨（humerus），在下肢为股骨（femur）。中段（前臂或小腿）则由两根骨头支撑，在上肢为尺骨（ulna）和桡骨（radius），在下肢为胫骨（tibia）和腓骨（fibula）。手掌骨分为三部分，分别是腕骨（carpal bones），掌骨（metacarpal bones）和指骨（phalanges）。腕骨共8块，分成平行的两列，每列四块，彼此以关节相连。掌骨共5块，分别和指骨和腕骨以关节相连。指骨共14块，其中2块在拇指中，其余4指各有3块指骨。这些指骨之间也以关节相连。这样，手掌就有很大的弯曲性和灵活性。这些骨头的构成特点，在其它动物身上也可以看见，只是大小、长短和形状有些不同，说明这样的结构来自共同的祖先。
现在地球上所有的四肢动物（tetrapod，例如青蛙、蝾螈、蜥蜴、老鼠、以及人类自己）中，每肢都有5根手指或脚趾（英文叫digits）。虽然人和动物都有多指症，但是那多出来的指头在形态上都和五指中的一只（例如拇指或小指）相同，说明是某根手指加倍而形成的，而不是一根与其它指头不同的新手指。鸟类的翅膀相当于四肢动物的前肢，鸟类的腿相当于四肢动物的后肢，肢体各段的结构也彼此对应，只是鸟类的指头数量要少一些，翅膀只有3根指头，腿只有4根趾头。研究发现，这是由于从恐龙到鸟的变化中一些指（趾）头退化而造成的。例如鸟类的恐龙祖先“兽脚亚目恐龙”（theropod）的第IV、第V趾退化，使得鸟翅只有三根指头，所以鸟类的3根指头相当于四肢动物的趾头I、II、III。而鸟类腿上的四根趾头则相当于四肢动物的趾头I-IV。这说明无论是两栖类、爬行类、鸟类还是哺乳类，5根手指或脚趾都是普遍规律。
问题是，这样的结构是如何形成的？是什么原因使动物的四肢都发展出近段-中段-掌段这样的结构，而且都由一根骨头-两根骨头-五指（趾）骨头支撑？在人的DNA序列中，是找不到这样的“设计图”的，我们在DNA序列中能够看见的，只是为蛋白质编码的序列和控制编码序列转录的调控序列。那么一根骨头、两根骨头、五根手指（脚趾）的“设计”又在哪里呢？
所有这些都是科学家深感兴趣的问题，也进行了大量的研究，特别是用小鸡（chick，代表鸟类）和小鼠（mice，代表四肢动物）所进行的详细研究。这些研究揭示了动物四肢发育的分子机制，是动物身体结构形成原理很好的范例。研究结果表明，由Spemann提出的“组织中心”学说，Wolpert提出的“法国国旗学说”和由Turning提出的“反应-扩散学说，即图灵学说”在肢体的发育过程中都起作用。而在这些发育过程中起作用的“成型分子”，也都是我们前面介绍过的“工具分子”。
小鼠上肢和小鸡翅发育的“组织中心”
要知道小鼠的上肢是如何从肢芽发育成的，我们首先需要了解小鼠上肢结构的特点。这些结构特点也代表了其它动物上肢和鸟类翅膀的结构特点，所以对它的研究具有普遍意义。小鼠的前肢有三根方向轴，一个是近端-远端轴，它定义前肢各部分与躯干之间的相对位置。离躯干最近的为近端（proximal），是上臂（stylopod）的位置。离躯干最远的为远端（distal），是掌段中脚趾的位置。上肢的结构在这条轴线上是不对称的，例如上臂部分和脚掌部分就不以中段为对称中心而对称。这条轴线英文叫proximal-distal axis，简称为P/D轴。第二根是前后轴（anterior-posterior axis，简称A/P轴）。小鼠头的方向为前，尾的方向为后。上肢结构在这条轴线上的结构也是不对称的，例如5根脚趾（相当于人的拇指、食指、中指、无名指、小指）在前后轴方向上就不对称，拇指就不是小指的镜面结构（假设以中指为对称轴）。第3根轴是背-腹轴（dorsal-ventral axis，简称D/V轴）。这就类似于人的手心和手背，它们的皮肤结构是不一样的，手心无毛，而手背有毛。要成功地发育成一根完美的上肢，小鼠必须在这三个方向的轴上都有控制中心，告诉细胞它们在这三个方向上的位置，从而决定它们形成相应的结构。这相当于定义一点在空间中的位置需要X、Y、Z三根彼此垂直的轴。研究结果证明，小鼠在这三个方向轴上真的都有Spemann说的“组织中心”，它们通过如Wolpert的法国国旗理论说的那样，通过扩散性分子的浓度梯度，控制上肢的发育。小鸡翅的构造和小鼠的上肢类似，形成原理也相似，所以对这两个动物肢体发育的研究可以相互补充和促进。
小鼠的肢芽是由来自“侧板中胚层”（lateral plate mesoderm）的间充质细胞迁移到肢芽形成处大量增殖，使包在这些细胞外面的外胚层（ectoderm，也即外细胞层）向外突起而形成的。这些间充质细胞后来就发育成为骨骼和关节处的软骨细胞。由这些细胞形成的骨头和关节就决定了上肢的构造，肌肉、血管、神经都是围绕这些骨架建造的。
控制近-远轴方向结构形成的组织中心AER
在到达肢芽位置后，这些间充质细胞就分泌“成纤维细胞生长因子”（FGF）家族中的成员FGF7和FGF10（见文章第一部分，扩散性信号分子）。这些扩散性蛋白分子使得与其相邻的外胚层细胞发生变化，形成指挥近-远端轴（即P/D轴）的控制中心，也就是Spemann提出的“组织中心”。因为它处于肢芽的顶端（离躯干最远），所以叫做“外胚层顶脊”（Apical Ectodermal Ridge，简称AER，为了简洁，以后我们也使用AER这个简称）。这个细胞团对于肢体的发育非常重要，除去AER，肢体的发育就停止，而且除去AER的时间越早，则肢干的缺失程度越大，例如只形成近段（stylopod），而其它两部分（中段zeugopod和掌段autopod）缺失。反过来，如果把另一个AER移植过来，则会形成另一个肢体，常常是附近一个正在发育中的肢体的镜面结构。这些结果都说明，AER的确是动物上肢或翅的一个组织中心。
在外胚层下植入浸有FGF10的小珠，会诱导出新的肢芽，说明间质细胞分泌的FGF10是AER形成的“启动分子”。AER接收间质细胞发出的FGF10的信号，活化Wnt家族的蛋白质Wnt3a，Wnt3a又诱导AER中的细胞分泌FGF8。FGF8扩散回AER下面大约200微米范围内的间充质细胞之间，让这些间质细胞处于可塑状态，并且快速增生，形成一个由这些间质细胞组成的“增生区”（Progress zone，简称PZ区）。PZ区的细胞都按近-远端方向排列，它们的高尔基体都位于细胞的远端，这样PZ区间质细胞的增殖就会使肢芽在近-远端方向不断延长。控制细胞有方向排列的是Wnt5a蛋白，它是由来自AER的FGF信号诱导的。如果Wnt5a基因被突变，PZ区的细胞就失去方向性，形状变圆，这些细胞的增殖就会形成细胞团，而不是形成长度大大超过粗度的肢体。加入Wnt5a又会使细胞恢复方向性。
AER分泌的FGF8，还会使PZ区的间质细胞继续分泌FGF10，维持AER的存在。这样就在AER和PZ细胞之间形成互相依赖的正反馈循环。如果用非肢芽区的间充质细胞取代PZ区的细胞，AER就会退化，肢体的发育也会停止。
如果把肢体发育早期的PZ区的细胞移植到发育较晚期的肢芽上，会在已经形成的结构上重复形成同样的结构，例如在已经形成的桡骨和尺骨的远端再形成另一套桡骨和尺骨。但是如果把较晚期的PZ区细胞移植到较早的肢芽中，则会造成中间结构的缺失，例如桡骨和尺骨缺失，趾头直接连在肱骨上。这说明在肢体发育过程的不同阶段中，PZ区的细胞能够形成不同的结构，而且一旦PZ区的细胞确定了自己的“前途”，即使换一个地方，也会长出同样的结构。例如把前肢PZ区的细胞移植到后肢的肢芽上，会形成后肢的近段（例如股骨）和前肢掌段的趾头。与此相反，把早期的AER移植到晚期的肢体上，或者把晚期的AER移植到早期的肢芽上，肢体的发育都不受影响。把后肢的AER移植到前肢的肢芽上，长出来的仍然是前肢。这说明只有PZ区的细胞才能随着时间和空间（随着肢芽生长分化而不断移动的位置）的变化决定自己的命运，决定是分化形成前肢还是后肢的结构，是形成近段、中段、还是掌段。AER 只给出FGF信号，不决定前后肢的区别，也不决定肢体形成的结构是近段、中段、还是掌段。
控制前-后轴方向结构形成的组织中心ZPA
AER对肢芽生长的控制方向是沿着P/D轴的，即控制近端-远端结构的形成。但是肢体的发育还需要前-后端（沿着A/P轴）的控制机制，例如在中段中，桡骨位于前端，尺骨位于后端。在掌段中，拇指位于掌的前端，小指位于掌的后端。然而桡骨、尺骨、和5套指骨的方向都是和P/D轴平行的，AER不能有效地控制它们之间的区别性发展，而需要一个与P/D轴垂直的信号中心，控制肢体前后轴方向发育，这就是位于肢芽后端（相当于人的下端）部位的一团细胞，叫做“极性活化区”（Zone of polarizing activity，简称ZPA）。它分泌“音刺猬蛋白”Shh（见文章第一部分，扩散性信号分子）作为扩散性的信号分子，在肢芽中形成从后到前，浓度不断降低的浓度梯度，控制上肢沿前-后轴（A/P轴）的结构形成。与AER是由外胚层细胞组成不同，ZPA是由肢芽后端外胚层下面的间充质细胞组成的。
将额外的ZPA移植到肢芽的前端，就会使肢芽有两个A/P轴方向的ZPA信号中心，同时从前端和后端发出信号，结果就会形成以P/D方向为对称轴的镜面结构，例如在掌段，从前端到后端，会在同一个掌段依次形成第4、3、2、2、3、4趾，原来离ZPA最远，因而接收到最低Shh浓度的第1趾消失，第5趾也消失。把Shh基因插入病毒，感染鸡的成纤维细胞，再把这些表达Shh的成纤维细胞植入到肢芽的前端，同样会形成镜面结构。如果把小鼠的Shh基因敲除掉，肢芽的形状就会变瘦变尖，中段zeugopod和掌段autopod的发育都会出现异常。但如果小鼠中抑制Shh的Gli3基因敲除掉，肢芽就会变得很宽，并且形成多趾，说明Shh的确是控制肢芽前-后轴方向结构形成的扩散性分子。
ZPA和AER是互相依赖的。ZPA分泌Shh需要来自AER的FGF8的作用，Shh又会反过来诱导AER分泌FGF4。AER分泌的FGF4和FGF8会扩散到ZPA，维持Shh的表达。
控制背-腹轴方向结构形成的基因Wnt7a和En1
肢体，特别是肢体的掌段，明显地分为背-腹面。这个方向的轴线也被称为背-腹轴（dorsal-ventral axis，简称D/V轴）。例如掌的腹面（相当于人的手心）是不长毛的，而背面（相当于人的手背）长毛，皮肤的结构也不同。控制掌段背-腹轴分化的一个基因是Wnt7a基因，它表达于背面外胚层的细胞中。Wnt7a分子从这些细胞分泌出来以后，扩散到背面的间充质细胞之间，诱导这些间质细胞合成转录因子Lmx1，让肢芽发展出背面的结构。敲除Lmx1基因会使小鼠掌段的背面变成腹面，这样掌段的两面都会长出腹面的皮肤，相当于人的手两面都是手心。
另一个基因，engrailed，简称En1，表达在肢芽腹面的外胚层细胞中。它能够抑制Wnt7a的作用，使背面结构不能在腹面发展，使得腹面结构得以形成。
T盒子基因控制前肢和后肢的发育
既然前肢和后肢的发育都是由AER、ZPA和Wnt7a控制的，为什么还会有前后肢的区别呢？这是因为前后肢的发育还为另一组基因所控制，即T盒子基因（T box gene，简称Tbx基因）。
Tbx基因家族的产物是转录因子，都含有一个叫做T盒子的DNA结合区段。其中Tbx5蛋白控制前肢的发育，而Tbx4蛋白控制后肢的发育。如果把浸泡有FGF的小珠植入鸡的胚胎中，则会在植入处的前端诱导Tbx5基因的表达，在植入处的后端诱导Tbx4基因的表达，说明FGF可以控制这两个Tbx基因在胚胎的不同部位表达，形成前肢或后肢。
Tbx基因对于心脏的发育也是必要的。Tbx5基因的突变会导致Holt-Oram综合症。除了上肢畸形，例如拇指像其它指头，手指弯曲外，左心室和右心室也不能分隔开。
视黄酸RA的作用
除了在肢芽顶端的AER影响近-远轴（P/D轴）方向的结构以外，从P/D轴另一端来的视黄酸（retinoid acid，简称RA，见文章的第一部分）信号也参与肢体的发育。用化学药物阻断RA的合成，就会阻止肢芽的形成。如果把蝌蚪的尾巴切断，再浸泡在RA的溶液中，在尾巴的断处会长出许多只脚，说明RA对于肢芽的形成是非常必要的。但是RA只在诱导肢芽的形成过程中起作用，对于随后肢体结构的形成没有影响。RA可以抑制来自AER分泌的FGF8的作用。在近端RA的浓度高，活化为近端结构形成所需要的基因，而在远端FGF8的浓度高，活化为远端结构形成所需要的基因。视黄酸的作用，也符合Spemann的组织中心学说，即某些细胞分泌的扩散性分子控制远距离细胞的命运。
趾头的形成也遵循图灵原理
AER和ZPA的功能和它们分泌的扩散性分子说明，Spemann的组织中心学说是正确的，在指导动物肢体发育中发挥作用。另一方面，肢体中段的桡骨和尺骨，掌段的5指，又具有明显的周期性，即在A/P轴方向上显现出成骨-不成骨-成骨这样的周期。特别是在掌段，这样的周期达到5个，使人猜想图灵原理也在起作用。Spemann的组织中心学说只要求这些组织中心分泌出扩散性的信号分子，并不一定要求（但是也不排斥）这些分子之间要相互抑制。AER分泌的FGF8，ZPA分泌的Shh，都是很好的例子。但是图灵理论却是“反应-扩散理论”（reaction-diffusion theory），要求至少一个正调控的分子和一个抑制性分子。要在肢体的发育过程中证实图灵原理，鉴定出这两类分子，是很困难的，因此在长时期中，图灵学说只在身体表面的图案形成中（例如动物皮肤上的斑纹和毛囊位置的确定）被证实，而在动物身体内部器官的形成过程中是否也起作用，一直是一个未知数。
这种情形最近才改变。2014年，西班牙的科学家James Sharpe等人用小鼠五趾形成过程中各种基因表达区域的信息、基因敲除技术、以及计算机模拟等研究方法结合起来，证明了小鼠五趾的形成过程遵循图灵原理。
这些科学家首先测定了肢芽中要形成五趾的区域和五趾之间的区域中，各种基因的表达状况。他们发现，形成趾骨的关键基因Sox9在五趾形成区高度表达，而在趾间区域的表达水平很低。Sox9基因对于趾骨的形成是绝对必要的，如果Sox9基因失活，就没有趾头形成。与Sox9基因的表达区域相反，骨形态发生蛋白BMP（主要是BMP2、4、7）和Wnt蛋白的工作信号（分别为Smad和b-连锁蛋白，见本文第一部分）在趾间区最强，在成趾区很弱。而在前-后轴方向上，FGF的表达程度没有明显变化，这也和分泌FGF的AER在方向上是和前-后轴垂直的情形一致的。这些结果说明，BMP和Wnt两种扩散性分子可能在五趾的形成中起控制作用。
科学家早就知道，BMP能够增加Sox9基因的表达，即促进指骨的形成，而Wnt抑制Sox9基因的表达，阻止趾骨的形成。在成趾区，BMP的下游分子Smad有高表达，证明趾间区里面的间充质细胞分泌的BMP能够扩散到成趾区去，在那里诱导Sox9基因的表达。这样我们就已经有了一个正调控的扩散分子BMP和一个负调控的扩散分子Wnt，符合图灵反应-扩散学说的要求。而且肢芽外胚层细胞分泌的Wnt分子能够抑制靠近外胚层的间充质细胞形成趾骨，使得趾骨只能在趾头的中轴区域形成。
如果把Sox9基因敲除掉，BMP和Wnt信号区域就不再显示出周期性，而是在整个掌区均匀分布，说明在成趾区的Sox9蛋白并不是BMP和Wnt的下游分子，而能够抑制BMP和Wnt的信号传递链，是BMP-Sox9-Wnt作用系统的成员之一。如果用BMP信号通路的抑制剂LDN-212854阻断BMP的作用，Sox9的表达就消失，没有趾头形成。如果用Wnt信号通路的抑制剂IWP2阻断Wnt信号通路，Sox9就会在整个掌区表达，证明Wnt的确在掌段的趾间区抑制趾骨的形成。这样，BMP蛋白通过扩散作用促进成趾区Sox9基因的表达，Wnt蛋白通过扩散作用在趾间区抑制Sox9基因的表达，而Sox9又抑制BMP和Wnt在成趾区的表达，这些作用就是形成五趾的图灵机制。
趾骨形成的图灵机制还可以从另一个实验中得到证实。Sharpe等人把发育中肢芽的成趾区细胞（高Sox9表达）和趾间区细胞（低Sox9表达）提取出来，分别放在培养基中在体外培养，结果在十几个小时之后，这两种细胞都自动形成了图灵学说预期的图案，即Sox9高表达的区域散布在Sox9低表达的区域中，类似于豹子皮肤上的斑点。这说明无论是成趾区的间充质细胞，还是趾间区的间充质细胞，都还保留了自动形成周期性图案的能力，是图灵学说最直接的证明。
当然这样形成的斑点并不是趾头的形状。但是如果把趾芽的生长过程考虑进去，并且用FGF和它控制的Hox基因来调节图灵图案的周期，计算机模拟就能够准确地复制出小鼠上肢趾头形成的图案。
从以上的介绍可以看出，在趾头形成的过程中，图灵机制和前面谈到的AER和ZPA组织中心都在起作用，所以趾头形成的实际过程是非常复杂的，涉及到多种控制机制的共同作用。
为什么我们有5根指头？
我们在前面曾经谈到，目前地球上所有的四肢动物都有5根手指或脚趾。对这个现象有三种解释。
第一种是图灵学说。掌段的间充质细胞本身就具有形成周期性结构的能力，这从掌区的间充质细胞在体外就能自动形成高和低Sox9表达水平的斑点状图案就可以得到证明。而图灵图案的周期性是可以调节的。在四肢动物身上，这样的周期调节正好可以形成5根趾头。
第二种是从ZPA组织中心分泌的Shh的控制作用。完全去除Shh信号通路会使中段的两根骨头变成一根，前端的桡骨形成，后端的尺骨消失。完全除去Shh信号通路使掌段只形成最前端的第1趾，比第1趾后端的4根趾头都消失了。这说明位于肢芽后端的ZPA分泌的Shh对后端骨头的形成是必要的。如果不让Shh蛋白上有胆固醇分子，在前端会形成更多的趾头，说明Shh可以向肢芽前端扩散得更远，诱导更多的趾头形成。但是如果不让Shh蛋白带有脂肪酸分子，就会造成第2趾的缺失，以及第3趾和第4趾的融合。这些结果都说明Shh信号对于趾头的形成和数量是有控制作用的。
Shh的一个作用就是控制Gli3R的作用。在没有Shh信号的情况下，下游转录因子Gli会被“蛋白酶体”切断，被切下来的羧基端进入细胞核，抑制基因的表达（见本文第一部分）。Shh能够抑制Gli分子被蛋白酶切断，而全长的Gli蛋白则是促进基因表达的分子。研究表明，在Gli蛋白家族中，Gli1和Gli2和趾头的形成无关，而Gli3的羧基端对基因表达有抑制作用，叫做Gli3R。由于Shh的浓度在肢芽后端更高，Gli3R的浓度会在肢芽的前端更高，起到抑制更多趾头形成的作用。如果敲除Gli3基因，就会形成更多的趾头。Shh在肢芽后端的高浓度和Gli3R在肢芽前端的高浓度彼此协同，控制趾头的生成。由于最前端的第1趾在没有Shh信号的情况下也可以生成，可以认为第1趾不需要Shh信号。
Shh的浓度在肢芽后端最高，但是趾头形成的顺序却是4-2-5-3。如果在不同的时间切断Shh信号，则最先失去的是趾头3，然后是5、2、4，和正常情况下趾头形成的顺序正好相反。对此现象的解释是，Shh对趾头形成的作用决定于间充质细胞接触Shh分子的浓度和时间，后端趾头的形成需要较长时间地接触Shh。在肢芽发育过程中用“环巴胺”（cyclopamine）阻断Shh信号会缩短间充质细胞接触Shh的时间，影响后端趾头的形成。再一个因素是，后端的间质细胞和高浓度的Shh长时间接触，会形成“去敏化”，即对Shh不那么敏感，因此第5肢（最后端的趾头）并不是最先形成的。
按照这些推理，掌段5根趾头对Shh的要求是：
第1趾，不需要Shh。
第2趾，需要Shh的长距离传输，短时接触。
第3趾，第2趾的形成会延伸到第3趾的形成。
第4趾，需要长时间接触Shh。
第5趾，第4趾的形成会延伸到第5趾的形成。
第三种解释是同源异形盒基因（Hox基因，见本文第一部分）对5趾身份的规定。在肢芽发育的过程中，Hox基因组里面的Hoxd基因中，只有5个基因，即Hoxd4、5、6、7、8在肢芽中表达（注意不要把这些数字与趾头的命名混淆起来）。它们都在肢芽的最后端表达，但是向前端表达的范围逐渐增大。例如Hoxd8只在肢芽的最后端表达，Hoxd7也在肢芽的后端表达，但是范围要广一些，超出Hoxd8基因表达的范围。Hoxd6表达的范围又超出Hoxd7的范围，Hoxd5表达的范围更大，Hoxd4则在整个肢芽表达。这样，肢芽中Hoxd基因的表达情形就分为5个区，所有5个Hoxd基因都表达的区域（4、5、6、7、8），位于肢芽的最后端，然后是只表达4个Hoxd基因的区域（4、5、6、7），位于（4、5、6、7、8）区域的前端，然后是表达3个Hoxd基因的区域（4、5、6），再是表达2个Hoxd基因的区域（4、5），最后是只表达Hoxd4的区域，位于肢芽的最前端。
这5个表达不同数量的Hoxd基因的区域，就对应于5根指头的身份。由于只有5个Hoxd基因以这种方式参与动物趾头的形成，所以四肢动物的趾头应该是5个。人的多指并不是长出了和正常的5指不一样的指头，而是其中一根指头的复制品。也就是说，四肢动物只能有5个趾头类型。四肢动物中较原始的棘鱼（Acanthostega，也叫石螈）的前肢有8根趾头。似乎违背了这个规则。但是仔细检查这8根趾头，发现它们也只属于5种类型，其中第I、第III、和第IV趾被复制，是双份。棘鱼的这种情形也许和它仍然主要在水中生活，需要较大的鳍来游泳有关。在这方面，棘鱼多趾的功能更类似鱼的鳍，由多根细长的鳍条支撑。陆生动物需要比较强壮的趾头来支撑动物的重量，多而细的趾头是不利于陆上生活的。5根趾头看来最适合许多动物在陆地上生活的需要，进化也就把这样的“设计”固定了下来。
这三种假说都能够在一定程度上解释为什么四肢动物有5趾，但是都缺乏整个控制过程的细节，所以现在还难以判断哪一种机制是正确的。细节的阐明有可能将这几种机制统一起来。
为什么鸭掌有蹼而鸡没有？
无论是小鼠的四肢，还是人的手脚，都是有指头（趾头）的。这不仅要求有形成趾骨的机制，还需要趾间的组织消失。在掌段的发育过程中，在成趾区之间的间充质细胞会分泌BMP蛋白。这些蛋白不仅能够诱导成趾区的细胞变成软骨，随后变成趾骨，还使得趾间区的细胞“自杀”（也叫“凋亡”，即细胞的程序性死亡，英文叫apoptosis）。
如果在细胞中表达对抗BMP分子的蛋白质，让BMP分子失去作用，不但会影响趾头的形成，趾间区的细胞也不会凋亡。由于BMP蛋白可以扩散到成趾区，促使那里的间质细胞形成趾骨，而BMP同时又能够使间充质细胞凋亡，因此在成趾区，间充质细胞表达的Sox9基因的产物能够诱导BMP的拮抗物Noggin基因的表达。Noggin蛋白可以保护成趾区的间充质细胞，使它们不启动凋亡的程序。
许多水鸟如鸭、鹅、鸳鸯、天鹅，脚趾之间都有蹼，以利于划水。这就是趾间的细胞没有完全凋亡的结果。如果把鸡和鸭后肢的肢芽互换，具有鸭间充质细胞的鸡就会长出有蹼的后肢，说明这些间质细胞里面已经有不完全凋亡的指令。
鱼的鳍是怎样进化成为四肢动物的肢体的？
鱼类是没有四肢的，靠鳍（fin）来游泳。鳍通常也有两对，分别是前鳍和后鳍。研究发现，动物的四肢，是从鱼类的前后鳍进化而来的。鱼在水中生活，身体的比重与水相似，基本上没有承重的问题，所以不需要能够承重的趾，而主要是靠多条细长的鳍条（fin ray）来维持鳍的形状和柔韧性。例如“幅鳍亚纲”（Actinopterygians）中的“斑马鱼”（zebrafish）的鳍有10根鳍条，其中5根还分叉。“软骨鱼”（Chondrichthyan）中的鲨鱼（sharks）有11根鳍条，都不分叉。“肉鳍鱼”（Sarcopterygians）中的“古鳍鱼”（Sauripterus）有17根鳍条，其中12条分叉；“潘氏鱼”（Panderichthys）有13根鳍条，其中8根分叉；“提塔列克鱼”（Tiktaalik）也有13根鳍条，其中8根分叉。
四肢动物的肢骨是“内骨骼”(endoskeleton)，在软骨的基础上由成骨细胞钙化而成。四肢动物在陆上生活，没有水的浮力，必须有能够承重的肢体，细长柔软的鳍显然是不能满足需要的。如果动物要奔跑，在掌段接触地面的一瞬间要经受巨大力量的冲击，更需要强壮的脚掌和趾头来承受这样的力量。由鳍条变为趾骨，长度变短，数量从10根以上减少到5根，看来是陆生动物最佳的选择。
而鳍条是“外骨骼”（exoskeleton），又叫“膜骨”（membrane bones），不经软骨阶段，而是由间充质细胞直接钙化而成。而四肢动物的趾骨是“内骨骼”（endoskeleton），要经过软骨的阶段，由成骨细胞取代软骨细胞，再钙化而成。这样的转变是如何发生的？在胚胎发育的初期，鱼身体侧面的鳍芽（fin bud）发育成为鳍，动物身体侧面的肢芽（limb bud）发育成为四肢。又是什么原因使得鳍芽发育成为鳍，而肢芽发育成为肢？
从鳍到肢内骨骼的变化
如果检查各种鱼鳍内部的结构，就会发现鱼鳍的根部还是有一些内骨骼的，而且逐渐变化成为类似肢体中的肱骨、桡骨和尺骨。例如在幅鳍鱼的鳍中，在靠近身体的地方就有两列内骨骼，其中近端的较长，远端的短小，和鳍条相连。这些内骨骼占鳍很小的一部分，在结构上也难以和四肢动物的肱骨、桡骨和尺骨相比较。而到了被认为是四肢动物祖先的肉鳍亚纲的鱼，鳍中的内骨骼的组成就已经很像四肢动物肢体中的近段和中段。其中的“提塔列克鱼”（Tiktaalik）的内骨骼被认为是和四肢动物的肢骨最相似的。最靠近鱼身体的只有一根骨头，相当于四肢动物的肱骨。鳍中与这根骨头以关节相连的，是两根骨头，相当于四肢动物的桡骨和尺骨。与这两根骨头相连的，是多列短小的骨头，类似于四肢动物的腕骨和掌骨。不过再远端还没有指骨，而仍然是鱼的鳍条。所以提塔列克鱼的鳍其实是鳍和肢的混合物，提塔列克鱼也被称为是“会走路的鱼”。从鱼鳍到完全的肢体，最后一步是趾骨的出现。
鳍变为肢的过程中基因表达状况的变化
如果检查鳍和肢发育过程中基因表达的状况，可以发现它们之间有许多相似之处。例如鳍亚和肢芽都有位于顶端的AER组织中心，而且AER的标志性基因如Wnt2b、dlx2、dlx5a、sp8、sp9，在鳍和肢的AER中都有表达。抑制sp8和sp9的活性，鳍芽就消失。FGF信号对于鳍的发育也是绝对必要的。在鳍发育的初始阶段，鳍芽中的间充质细胞表达FGF24，而FGF24能够促使FGF10基因的表达，相当于肢芽的间充质细胞表达FGF10。如果FGF24的基因突变，这些间充质细胞就不再表达FGF10，鳍芽也消失。随后，FGF24的表达转移到鳍芽的AER中。由于FGF24与FGF8属于FGF超级家族里面的同一亚家族，这相当于鳍芽的AER也表达FGF8。在鳍的发育过程中，FGF24既在间质细胞中表达，也在AER中表达。而在四肢动物中，是间质细胞先表达FGF10，FGF10再诱导AER表达FGF8。Shh蛋白也在鳍芽中表达，对于鳍的形成也是必要的。
鳍和肢基因表达的一个关键性差别，也许是在近-远方向轴（P/D axis）上两个Hox基因的表达方式不同。无论是在鳍芽还是在肢芽中，最近端表达的基因都是Meis1，它负责肢体中肱骨的形成和鳍中最近端的内骨骼的形成。比Meis1基因表达区域远端的，在四肢动物中是Hoxa11和Hoxa13。在斑马鱼中是Hoxa9和Hoxa11，相当于四肢动物的Hoxa11和Hoxa13。在四肢动物肢芽发育的初期，Hoxa11和Hoxa13的表达区域是完全重合的，但是随着肢芽的发育，Hoxa11和Hoxa13的表达区域逐渐分开，Hoxa11的表达区域与Meis1的表达区域相邻，负责桡骨和尺骨的形成，突变小鼠的Hoxa11，桡骨和尺骨就消失。而Hoxa13的表达区域在肢芽的最远端，负责趾骨的形成。Hoxa13基因的突变会造成趾骨畸形和融合。但是在鱼鳍中，Hoxa9和Hoxa11的表达区域一直重合，没有彼此分离的情形。成年蛙上肢再生时，Hoxa11和Hoxa13都表达在再生肢的间充质细胞中，但是它们表达的区域相互重叠，并不分离，所形成的新肢也就像一个椎状物，而没有五趾。这些现象说明，Hox基因表达区域的区分看来是四肢动物中掌区骨头发育的关键。
这种Hox基因分段表达的一个后果就是AER内面间充质细胞形成的功能区域。在四肢动物中，与AER直接相邻的间质细胞形成“增生区”（Progress zone，简称PZ区，见本节前开始部分），它依次发育为肢体的近段、中段、和掌段。而在鳍芽中，AER会形成一个叫“顶褶”（Apical fold，简称AF）的结构。AF由两层上皮细胞组成，间充质细胞在这两层上皮细胞之间的空间中形成鳍条。四肢动物的肢芽不会形成AF，也没有鳍条区域。估计是基因表达方式的变化，很可能是两种Hoxa基因在近-远轴方向上的分段表达，使得AF结构消失，代之以增生区PZ，才使得四肢动物中的掌段得以发展出来。
鱼鳍和四肢动物的肢体之间的比较说明，许多为四肢动物肢体发育所需的基因，如Meis1、FGF、Wnt、Hox，在鱼类的鳍中就已经出现了。它们表达的位置和控制这些身体附件发育的方式也相似，也通过AER与下面的间充质细胞相互作用来引导这些结构的发展。这不但支持四肢动物的前后肢是从鱼鳍进化而来的理论，也表明生物在身体结构形成上所使用的“工具分子”是高度保守的。
为什么鲸鱼和海豚的趾骨数特别多？
鲸鱼和海豚是哺乳动物，是四肢动物下水演变而成的。它们和四肢动物一样，具有5根趾头。但是鲸鱼和海豚的五趾并不分开，而是在前肢位于像鱼鳍那样的器官中，后肢形成像鱼尾的结构，在方向上和鱼尾垂直。不仅如此，比起人和小鼠来，它们每根趾的趾骨数量要多得多。人手的拇指只有两个指骨，其余的手指有三个指骨。而鲸鱼和海豚的第2趾有7块趾骨，有的海豚第2可以有多达11块趾骨。这些趾骨数量的增加估计是和这些在水中生活的哺乳动物四肢变回鱼鳍形状的游泳器官有关。
四肢动物趾头中趾骨的数量看来和间充质细胞接触来自AER的FGF8信号在时间的长短有关。延长FGF8信号的作用时间，就会形成更多的趾骨，而在趾头发育过程中破坏AER，或者用FGF受体的抑制剂，FGF信号链消失，就会形成趾尖，结束趾头的发展，导致数量少于正常的趾骨。
小结
动物肢体的发育过程证明，是扩散性信号分子和它们的抑制物之间的相互作用在三个相互垂直的方向上控制着肢体形成的过程，特别是由Spemann组织中心分泌出的扩散性分子（AER分泌的FGF8和ZPA分泌的Shh）从两个相互垂直的方向控制肢体的发育。这个过程是动态的，随着肢芽的发育，AER内增生区（PZ区）的间充质细胞会有不同的命运，依次变为近段的肱骨，中段的桡骨和尺骨，掌段的腕骨、掌骨和趾骨。手掌的背-腹面则被Wnt7a和En1基因分别控制。在同时，增生区的间充质细胞又具有自我形成周期性结构的能力，通过BMP-Sox9-Wnt系统控制掌段成趾区和趾间区的形成，而这种周期的大小又由FGF信号和Hox基因调节，形成五趾，证明了图灵学说的正确性。这些基本的调控原理在鱼鳍的发育中就开始起作用，也许是两个Hox基因在近-远轴上表达区域的分离让鳍条的区域消失，掌区得以发展出来。
近年来的科学研究已经提供了动物肢体发育的大量信息，但是与动物肢体结构的复杂性相比，这些结果还是很初步的和粗线条的。例如五根趾头的长短和形状就彼此不同，每个指骨也是在靠近关节的地方较粗，中间部分较细。肱骨、桡骨和尺骨也不是粗细均匀的圆棍，而是各有特定的形状。这些特殊的形状都需要更精细的调节。围绕骨头的肌肉、血管、神经是如何生成的，还是尚未被解答的问题。尽管如此，已经获得的研究结果已经向我们展示生物结构形成的控制机制究竟是什么，DNA的蓝图功能是怎样实现的。虽然我们还不知道四肢形成的所有细节，但是从上面的研究结果可以推测，这些发育过程也是通过信号分子，包括扩散性信号分子和细胞-细胞之间直接相互作用来完成的。
主要参考文献
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- [6]张立新
- 好文
- [5]lrx
- 文章要是有图就好了。
- 博主回复(2015-5-15 13:02)：我也想配图，但是因为现成的图多有版权问题，只好尽量用文字说明。
- [4]xuexiyanjiu
- 系列科普——点赞。
- 博主回复(2015-5-15 13:01)：谢谢鼓励。
- [3]夏循礼
- 朱老师，您辛苦了！
- 博主回复(2015-5-15 13:01)：谢谢关心。
- [2]用户名
- 评论已经被科学网删除
- [1]am79
- 如果让你自己设计一套DNA序列，你知道它最终会创造出一个什么样子的生物体吗？我猜，在离开细胞结构而只谈DNA的前提下，这个问题应该没有答案。
- 博主回复(2015-5-15 13:00)：同意你的意见。基因调控机制非常复杂，不仅有细胞内，还可以通过细胞之间的作用。细胞内也是通过非常复杂的网络，有时间差。胚胎的发育还分阶段。了解所有这些信息不但目前办不到，在以后相当长的一段时间内也办不到。
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