這是 http://bc.imb.sinica.edu.tw/images/biotech/18_20.pdf的 HTML 檔。
Google在網路漫遊時會自動將檔案轉換成 HTML 網頁。
Page 1
263
第十八章
基因治療
Gene Therapy
黃麗華
台大醫院 肝炎研究中心 教授
一、前言
遺傳工程技術的發展，開啟了科學家們對於生命的奧秘有深層探討，人們也嘗試藉由高
度發展的技術，為人類世世代代難以解決的一些醫療問題，提供更佳的解決之道。在
1960-1970 之間，由於對一些會轉型(transformation)的病毒有了進一步的了解，開始有人嘗
試以此類病毒作為一個載體，將外來的基因送入一個特定的細胞內。隨著這些技術的發展，
以及我們對於某些疾病的逐漸認知，基因治療的觀念於是衍生。若是我們能夠利用這些技術，
針對一些已知某個基因缺陷所引致的遺傳疾病進行治療，是否即可拯救這些具有遺傳疾病的
千千萬萬的病人呢？這個想法固然非常簡單且值得，然而進一步的研究工作即發現了這個課
題所存在的複雜性及多元性。事實上，基因治療必須綜合基礎科學的知識及臨床的經驗、診
斷方能奏效。而一個成功的基因治療則必備二個充分條件，那就是要有好的基因轉殖及基因
表現。以我們目前所具備的能力和知識，基因治療是無法達到矯正所有的遺傳疾病，但至少
有些疾病，目前的確是可經由基因治療加以解決。在這篇文章中，作者將對基因轉殖的方法
及目前可藉助於基因治療的疾病作一簡單的介紹。
二、基因治療所用之基因轉殖的方法
基因治療的目的在於攜帶一個（或一些）基因進入體內，達到治療或延緩病程的效果，
以改善病人缺陷及生活品質。成功的基因治療需要有好的基因轉殖技術。當基因體時代來臨，
許多疾病相關的基因都被陸續發掘出來之後，接下來就是如何去利用這些基因，進行疾病的
治療。但截至目前，要很有效率地攜帶基因進入個體，仍存在相當大的挑戰性。目前基因轉
殖的技術大體可分為二大類，一是利用病毒作為載體（vector），另一類則是非病毒載體。在
選擇何種技術之前，應先了解各種疾病或標的細胞的特性，以及治療的目的為何。以下則是
針對各類之基因轉殖技術，作一簡單介紹。
1. 病毒載體的方法
病毒載體的設計，首先是先決定哪些序列對病毒的複製、包裹，及傳輸至標的細胞是
必要的，將這些序列保留在載體設計上，其餘可丟棄的序列將之剔除，取而代之的是欲用
以治療用的基因序列。至於被剔除之序列所做出之蛋白質，可由另一質體或特定細胞株來
Page 2
264
提供其類似的功能（例如：病毒包裹用之結構蛋白，可由一個包裝質體或包裝細胞株來提
供）。將這些載體及包裝用質體共同送入同一細胞內表現，則可組裝出重組病毒（圖一）。
將此重組病毒用來感染選定之標的細胞，病毒載體則可經由其特定之方式進入細胞內進行
基因表現，如此一來即可達到基因轉殖及表現的目的。
圖一、載體設計之基本原理
(A)病毒原本之基因序列。(B)基因治療用載體之設計。將病毒
有關複製蛋白之基因置於一個包裝質體上，而病毒載體上只保留複
製所需之一些相關序列（黑色框框），然後將治療用之轉殖基因置
於其中。(C)包裝質體及帶有轉殖基因之病毒載體必須在同一細胞內
表現，即可形成重組病毒顆粒。
Page 3
265
病毒載體有些可將 DNA 序列帶入宿主的染色體上（例如反轉錄病毒載體，腺相關病毒
載體），有些則存在染色體外（例如腺病毒載體）。每種病毒載體都有其優、缺點。但一個
理想的病毒載體必須具備以下一些基本條件：
(1) 有效及容易製備；
(2) 安全，無強烈的副作用；
(3) 可長期，有調控性的表現基因；
(4) 可準確地傳送基因至指定的標的細胞；
(5) 具有感染分裂及不分裂細胞的能力；
(6) 可準確地插在特定的染色體位置上。
當然這是理想中最好的病毒載體，然現今所用之病毒載體尚未有哪一個具備如此好的
條件，也是病毒學家目前正在努力的方向。以下就目前較常用的幾種病毒載體作一介紹。
(a) 傳統反轉錄病毒載體（Retroviral vector）
大部分目前基因治療所使用的反轉錄病毒是來自老鼠的反轉錄病毒（MLV），它也是
最早用來進行人體試驗的病毒載體。這是個 RNA 帶有被膜（envelope）的病毒。其生
活史中，會經由反轉錄作用而形成雙股 DNA，再嵌插在宿主染色體上，達到基因轉殖及
持續表現之特色。要建構此載體，通常是將病毒基因上所有病毒基因序列加以剔除而裝
上我們有興趣的基因。但一些重要序列，如包裹用訊息(packaging signal，φ)，嵌插在
染色體上所需之序列（LTR），及複製相關之序列（polypurine tract， PPT），則必須保
留在載體上。有人甚會將一些增加基因表現或增加病毒力價有關序列，例如 WPRE 或
gag 5'端的部份序列，亦放在載體上，以增加載體之表現效率（圖二）。
載體上之 5'及 3' LTR 可進一步加以改良，以增加其表現能力及安全性。如圖二中
所示將 5' LTR 上之 U3 啟動子改為 CMV 之 enhancer/promoter，則此 CMV/LTR 嵌合啟
動子（hybrid promoter）可有更高的表現能力。而在 3' LTR 上的 U3 處將啟動子序列加
以破壞，則造成所謂 SIN 載體（self-inactivating vector）。其主要原理是利用反轉錄病毒
載體之反轉錄步驟，則 3' LTR 上之 U3 屆時將成為 5' LTR 上之啟動子。如此破壞的結果，
造成其〝自我去活化〞。這個用意主要是在減少在標的細胞內表現時，反轉錄病毒載體之
內在啟動子與 LTR 之間形成互相干擾表現的現象。但此類載體的設計，亦會大大降低其
載體病毒力價。
至於要形成重組病毒所需之其他病毒蛋白，如 gag、pol 及 env，通常是由另一個質
體（即所謂包裝質體）來提供。為了要避免此質體與表現載體之間產生任何重組而形成
野生型病毒，這個包裝質體上之包裹訊息 (φ)、 PPT、3' LTR 均會全部予以剔除，且
5' LTR 也會換成 CMV 之類的啟動子。更進一步的改良；則是將 gag、pol、env 等分裝
在不同質體內，再以穩定表現方式送入特定細胞內，建立所謂的包裝細胞株（packaging
cell line）。如此就更減少重組回野生型病毒之慮（圖二）。目前使用之 env 多半是選自
amphotropic 之反轉錄病毒，故所製造出來之重組反轉錄病毒具有可感染多種不同細胞
的特性。
Page 4
266
雖已有如此多重的改善，然反轉錄病毒只能感染分裂中的細胞，且其病毒之力價偏
低（105-106 cfu/ml），在體內又非常脆弱，易被補體所摧毀，造成反轉錄病毒載體使用
上仍有很大瓶頸。針對這個問題，目前已有一些改良式的反轉錄病毒載體出現。即是利
用水性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）之 G 蛋白來取代反轉錄病毒之被
膜蛋白，用以包裹病毒顆粒，形成所謂的假形反轉錄病毒（pseudotyped retrovirus）（1）。
這類假形病毒顆粒具有相當高的穩定性，並經得起離心，濃縮，故可使病毒力價提升至
108-109 cfu/ml，大大地提高了感染的效率。
圖二、傳統反轉錄病毒載體及包裝系統
(A)野生型反轉錄病毒基因體序列。(B)~(C)為不同之反轉錄病毒載體。(B)第一
代之載體，保留反轉錄病毒之 LTR，Ψ包裹訊息，及 PPT 序列，以供複製包裹之用。
(C)修飾之反轉錄病毒載體。5’LTR 改為 CMV/LTR 之嵌合啟動子。3’LTR 之 U3 啟動
子加以破壞（倒三角形）以增加其安全性。(D)較新型之反轉錄病毒載體。完全利用
CMV 啟動子表現轉殖基因，且加入 WPRE 序列，可增加基因表現。(E)~(F)為包裝
系統。(E)第一代之包裝系統，Ψ包裹訊息剔除且 ecotropic env 改為 amphotropic，
以增加其宿主範圍。(F)最新型之包裝系統，乃是將病毒基因體分開成兩個質體。而
且 5’LTR 改為較強之 CMV 啟動子，3’LTR 改為一般 poly A 序列。
Page 5
267
(b) 人類反轉錄病毒載體（lentiviral vector 或 HIV vector）(2)
人類反轉錄病毒與傳統反轉錄病毒最大不一樣在於它可以感染不分裂的細胞，且其
基因體上大多具備了許多輔助因子基因，對其生活史上可能具有某些功能。相似於傳統
之反轉錄病毒載體的設計，HIV 載體亦須帶有重要之序列以利載體之複製及包裹。例如
A
B
C
圖三、人類反轉錄病毒載體及包裝系統
(A)野生型人類反轉錄病毒基因體序列。(B)較新型之人類反轉錄病毒載
體，其上含有 PPT 序列，以及 WPRE 序列以增加基因表現。黑色倒三角形
表示 3’LTR 之 U3 被破壞（做為 SIN 載體）。RRE 為 rev response element。
以增加其安全性。(C)新的包裝系統。gag，pol 在一個由 CMV 表現之質體上，
rev 由另一個質體攜帶，以增加 gag-pol 質體之蛋白質表現。第三個質體則是
表現 VSV-G 之 env 蛋白。
Page 6
268
Ψ訊息序列；PPT 序列可增進病毒 DNA 送入核內的功能（3）；而載體的 3'端若有 WPRE
序列則可大大增加基因的表現（4）。
至於組裝病毒所需之結構蛋白，則是由另一個質體來提供。第一代的 HIV 載體系統
所用之包裝質體只剔除了 env 的序列，而由另一個質體 DNA 提供 VSV-G 之 env 蛋白，
約 80﹪的病毒序列仍保留在包裝質體上，故危險性較高。第二代的 HIV 載體系統，則將
一些輔助因子基因（如 vpr、vpu、vif 及 nef）從包裝質體上再剔除，只剩下由 HIV 之 LTR
啟動子所表現之 gag、pol、tat 及 rev。第三代載體甚且將包裝質體改為 CMV 啟動子，
故也不再需要 tat，而將其由此質體上剔除，甚且將 rev 分設在另外質體上。最後呈現之
HIV 載體（如圖三 B、C 中所示）是最具安全性的組合。利用 293T 高效率的轉殖技術及
VSV-G 可經得起濃縮的特性，一般都可拿到 1 x 108 -1 x 109 IU/ml 的病毒顆粒。不過每
次都得做共同轉染實驗，是 HIV 載體比較麻煩的地方，那是因為 HIV 載體系統比較難製
備成包裝細胞株，因為 VSV-G，gag 及 tat 等蛋白對細胞之毒性較高，除非做成可調控
性（inducible）的表現，否則很難建立起穩定表現的細胞株。
(c) 腺病毒載體（adenoviral vector）
腺病毒是一個中等大小（35 kb）之 DNA 病毒。感染人體之後，體內多半會引發免
疫反應（T 及 B 細胞）來清除病毒的感染。目前血清學檢查發現約有 40% ~ 60%的小孩
已有對抗血清型 1 型、2 型及 5 型病毒的抗體存在。而 Ad5 又是目前最常用於基因治療
載體設計的一種，故也是腺病毒載體在臨床上應用碰到最大的困難。強烈的免疫反應，
除了使轉殖基因只是短暫表現外，可能也會對病人產生極大的副作用，甚且休克。前一
陣子美國費城一位十九歲孩子利用腺病毒進行基因治療最後導致死亡，即是一個明顯、
慘痛的例子。
腺病毒的複製史中，有早期（E1A，E1B，E2，E3，及 E4）中期（IX 及 IVa 2），
及晚期（結構蛋白，ML）三個階段，其中 E1A 對其他早期病毒基因的表現是絕對必須
的。第一代之腺病毒載體是將 E1 及 E3 剔除（圖四 A, B）。E1 剔除是使重組腺病毒將來
在標的細胞內不具有複製能力。E3 剔除是為了增加容納轉殖基因的空間。使用載體的方
法，乃是利用同源基因重組（homologous recombination），將基因表現之卡帶質體與不
含 E1 部份之病毒基因體同時送入 293 細胞，經過重組後，再由 293 細胞所提供的 E1
基因來複製重組病毒。重組病毒可用來感染標的細胞或個體組織。腺病毒的力價一般非
常高（1010 cfu/ml），病毒顆粒穩定，所以常可用來直接進行體內（in vivo）轉殖。腺病
毒的感染，並不要求細胞分裂，這些都是它優於反轉錄病毒之處。但相對的，腺病毒不
嵌插在細胞染色體中，又不會在細胞內複製，故在一段時間後，經細胞分裂，病毒 DNA
可能就消失掉，表現亦告中止。同時，如前述腺病毒載體在體內造成非常嚴重的免疫反
應，這也是造成帶有腺病毒載體的標的細胞在體內很快就會被消滅的原因之一。
第二代腺病毒，為了更降低這些低量的病毒複製的機率及免疫反應的發生，進一步
再將 E2a 基因（DNA-binding protein）及 E4 由載體上去除（5），而改由製備細胞株來提
供。第三代病毒載體甚至將更長的病毒基因體完全去除（圖四 C,D）而用 helper virus
Page 7
269
來幫忙（6），以企圖完全斷絕病毒載體在標的細胞內的複製能力，如此一來即可大大降低
宿主的免疫反應，以及增長載體基因的表現時間。
(d) 腺相關病毒載體（adeno-associated viral vector, AAV）
腺相關病毒是個非常小（約 5 kb）之單股 DNA 病毒（圖五）。基因體的二端序列 ITR
（inverted terminal repeat）是複製所必須，在構築載體時，必須保留。至於中間之病毒
基因部份（cap 及 rep），則由外來的基因所取代（圖五 B），cap 及 rep 一般是由另一個
不帶有 ITR 的質體（即 helper plasmid）或包裝細胞株所提供（圖五 D）。這二個質體經
共同轉染至 293 細胞，加上 adenovirus 的感染，即可生成重組病毒，再用以感染標的細
胞。AAV 之感染宿主範圍亦廣，且不要求細胞分裂。但在 adenovirus 不存在時，AAV
會嵌插在染色體上，形成穩定持續性表現。目前認為它可能會特別選擇在 19 號染色體
圖四、腺病毒載體系統
(A)野生型腺病毒之基因體序列。(B)第一代腺病毒載體只將 E1 及 E3 剔
除，轉殖基因置於 E1 處。(C)第二腺病毒載體是更進一步將 E2a 或 E4 也剔
除以減少複製機會。(D)第三代腺病毒載體幾乎把病毒中間基因體序列完全清
除，成為 gutless 載體。
Page 8
270
上。但是要有如此有效率、特異性的嵌插現象，是要有 rep 蛋白的存在（7），但它並不存
在於一般的 AAV 載體中；故通常重組 AAV 載體嵌插在染色體上仍是隨機性的。以質體
式的 AAV 載體在肌肉細胞或腦組織中表現，發現也可長達九個月之久。
AAV 載體的缺點是基因體太小，故可用之基因大小受到相當大的限制。為了增加其
容量，目前有設計為雙載體的方式。其設計原理是將一段基因分開成兩段，分別在二個
AAV 載體上，但其上一個帶有 splicing donor（SD）序列，另一個則加入 splicing acceptor
（SA）序列（圖五 C）（8, 9）。當病毒載體同時進入細胞內會頭尾相接，形成 concatamer，
透過 splicing signals 接連，即可將中間序列剔除而接成完整的基因在細胞內表現，其連
接效率據報導在 16﹪~ 70﹪之間（9）。
AAV 載體通常要藉由 helper virus（如腺病毒）才能組裝成病毒顆粒，如此一來就會
圖五、腺相關病毒載體系統
(A)野生型腺相關病毒之基因體序列。(B)腺相關病毒載體，含有 CMV 啟
動子、poly A 序列及轉殖基因，位於兩個 ITR 序列之間。(C)雙載體系統。將
轉殖基因分成兩部分分別在兩個質體上。第一個質體上含有啟動子，splicing
donor(SD) 及部分 intron；而第二個質體上含有部分 intron，splicing
acceptor(SA)，及 poly A 序列。(D)包裝質體，含有 rep 及 cap 基因部分，而
無 ITR。(E)協助腺相關病毒包裹之腺病毒蛋白質，有 E2、VA 及 E4，可置於
單一質體上。
Page 9
271
增加實驗步驟，需將 helper virus 去除。目前已知與組裝相關的基因主要就是腺病毒的
E2、VA 及 E4，故可單獨將這些基因放在一個質體（圖五 E），提供輔助包裹病毒的功能，
而省去了 helper virus 的問題。
(e) 其他病毒載體（Other viral vectors）
除了上述常用之病毒載體，目前也有一些其他病毒載體慢慢被開發出來。例如 疹
病毒（HSV）。這個病毒載體主要針對腦神經疾病。它的基因體很大，容得下又大、又多
的外來基因，但也因為太大，在製備病毒載體時是比較複雜麻煩的。目前主要有複製子
型（amplicon）、缺乏 IE 基因之複製缺陷型（replication defective）及減毒型（attenuated）
等三種不同之 HSV 載體（可參考文獻 10）。不過這三種型載體目前都還有其製備、或使
用上之問題。
另外也有一些具有複製能力之 RNA 病毒載體被開發使用，例如 Semliki Forest virus
等（可參考文獻 11）。這類正股 RNA 病毒會利用（+）股基因體複製出負股 RNA，再利
用此負股 RNA 複製成（+）股 RNA 及做出較短之 subgenomic RNA，可表現大量的結
構蛋白。利用其在細胞內具有複製的能力，若將我們的基因設計在結構蛋白基因的位置，
就可獲得相當高量的表現。有人就利用如此之重組 RNA，不管是直接打入在體外做好之
RNA 分子或將之先包裹成為病毒顆粒再打入體內，都會因為其複製的特性而獲得比 DNA
疫苗方法更高量之蛋白表現，而有較佳之免疫效果。
2. 非病毒載體的方法
基於病毒載體具有一些危險性，一些研究學者故而發展一些非病毒載體方式，希望能
提供較安全之基因傳送方式。這些非病毒載體的設計，無非都是朝向具有標的性、增加轉
殖效率、或者是增加移動至核內及嵌插的機會等等方向來設計。而目前所有非病毒載體的
共同最大瓶頸，仍在於如何使質體 DNA 能更快地脫離胞內體（endosome）以減少 DNA
被分解的命運。以下則是將幾種較常用之非病毒載體系統加以介紹。
(a) 微脂粒（liposome）
由於 DNA 帶極大負電，不可能直接穿過細胞膜而進入細胞內。有人發展利用一些磷
脂類，具不同帶電性或極性者，以不同比例組合形成微脂粒，再將核酸與這些微脂粒混
合，將 DNA 包裹於其中，如此一來，DNA—微脂粒複合物就可直接通過細胞膜送入細
胞內。這個方法可普遍用於各種不同細胞，且可直接 in vivo 使用。此法基因轉殖效率的
高低依其磷脂的比例、種類成份而定。並且經由此法進去細胞內的 DNA，其表現均屬短
暫性的，到目前為止，這個方法的效率普遍均不是特別高。這是它尚未普遍被採用的因
素之一。
(b) 直接 DNA 注射肌肉（DNA injection）
這是非常不尋常，但卻很獨特的方法，就是直接將 DNA 以針頭注射到動物四頭肌
Page 10
272
（quadricep），結果發現 DNA 可在肌胚細胞（myoblast）內存留一陣，且持續表現。但
DNA 並沒有嵌插到染色體上。當纖維母細胞融合形成多核的肌纖維管（myotubule）時，
DNA 仍保存且表現。這種 DNA 進入細胞的詳細機制目前仍不是非常清楚，但相信與注
射局部區域內有些組織受到傷害或注射時所增加的壓力有一些關聯性（12）。也有一些其他
組織內的細胞可利用直接 DNA 注射的方法而將基因傳送進去的，例如甲狀腺、有些腫瘤
細胞、肝細胞、皮膚細胞，及心肌細胞。而其餘的大部份組織或細胞則普遍對此方法是
無效的。這種直接注射 DNA 於肌肉細胞的方法，已證實的確會針對所帶進去之基因所表
現的產物產生免疫能力，包括體液性免疫（humoral immunity）及細胞性免疫（cellular
immunity）。所以基於它的方便性及有效性，目前這種被稱為 DNA 疫苗（DNA vaccine）
的方法，是大家所趨之若鶩的。
(c) 基因槍或電穿孔法（gene gun or electroporation）
楊等人設計一套基因槍，它能將 DNA 分子所塗布的金粉粒子以高壓加速的方法，穿
過細胞膜而送達至細胞內，進行表現（13）。利用這種機械式的方式，比較沒有特殊細胞條
件的要求。故這種方法可應用在多種不同的細胞、組織，甚且器官。其所用的 DNA 量亦
遠比微脂粒的方法來得少很多。利用這種方法，已有多篇例子成功地將 DNA 送達至肝、
皮膚、或肌肉等器官內，並觀察到 DNA 在 in vivo 內的表現。而最近也有人發展電擊的
方法將 DNA 送入細胞內。這個方法是利用高電壓將細胞膜上的脂質結構造成暫時性重新
排列（也許只有千分之一秒或千分之一分）（14），故而造成細胞膜上有洞，讓 DNA 有機會
進入細胞質內。只要細胞膜電壓被提升至幾百個 mV 以上，這種現象在所有的細胞都會
發生，故它可普遍用於各種不同組織或細胞。這種物理性的方法將 DNA 送入細胞內是較
為簡單且沒有副作用，所使用 DNA 量，也遠比微脂粒法來得少。可惜其傳送之 DNA 量
仍然非常有限，且表現也多為短暫性的。
三、應用基因治療之疾病
將治療性基因轉殖至個體以進行人類疾病之治療，最初重點都放在矯正基因缺陷的遺傳
性疾病。然而由於目前轉殖技術能力的有限，以及對某些基因表現的調控並未能充分了解，
故對複雜的疾病或由多個基因所引起的疾病，都還不是目前基因治療技術所能勝任的。相對
地，若是只有一個基因問題的疾病，以及對基因產物量的需求較不嚴格限制者，則是目前基
因治療最好的對象（表一）。
除了遺傳性疾病，一些後天性疾病若能藉由某些基因的轉殖而改善其症狀者，亦屬基因
治療的範圍。例如癌症腫瘤、心臟血管疾病，及腦神經疾病等。事實上，由於疾病種類較多、
影響人口族群較為龐大，且許多情形是不要求基因具有長期表現的特性，目前基因治療應用
於後天性疾病的治療可能更勝於應用於遺傳性疾病。截至目前為止，基因治療已有不少例子
進入人體試驗，其中包括有遺傳性疾病者（如高氏症、嚴重性免疫不全症、血友病，及囊性
纖維化症等）及後天性疾病者（如多種癌症腫瘤、愛滋病，心臟血管疾病等）。現階段主要仍
在觀察各式載體逐升用量之安全性評估。以下則就一些疾病治療之原理作一簡單介紹。
Page 11
273
表一、適用於基因治療的一些遺傳性疾病
疾病
缺陷基因
標的細胞
嚴重性免疫不全症
adenosine deaminase,
骨髓細胞，
(SCID)
γc cytokine receptor
T 淋巴球
高式症
glucocerebrosidase
巨噬細胞
(Gaucher disease)
血紅素病變
α或β-globin
紅血球細胞
(sickle cell anemia or
α-andβ-thalassemias)
血友病
Factors Ⅷ or Ⅸ
肝細胞
(hemophilia A and B)
囊性纖維化症
CFTR
肺表皮細胞
(cystic fibrosis)
杜氏持續性肌肉萎縮症
dystrophin
肌肉細胞
(Duchenne muscular dystrophy）
巴金森症
dopamine
神經細胞
(Parkinson disease)
肺氣腫
(emphysema)
alpha-1 antitrypsin
肺表皮細胞
1. 遺傳性疾病
(a) 高氏症（Gaucher disease）
高氏症主要是因為缺乏β-glucocerebrosidase 而引起醣脂肪之儲存有問題，主
要受到影響的是巨噬細胞（macrophage）。利用反轉錄病毒載體，人們可以將好的
glucocerebrosidase 基因送入血液幹細胞中，經其分化所得之巨噬細胞就可以有正常
之基因產物表現，這群巨噬細胞可分布至骨髓、肝、脾及肺去執行正常的功能（15）。
(b) Adenosine deaminase (ADA)缺乏所引起之嚴重性免疫不全症（severe combined
immunodeficiency，SCID）
若缺乏好的ADA 基因， deoxyinosine或deoxyadenosine將無法轉變為inosine
及 adenosine。這個疾病造成 SCID 的原因是因為 T 細胞對體內累積之 adenosine
極端敏感，故會造成 T 淋巴球會嚴重失去功能。利用反轉錄病毒載體，人們嘗試將好
的 ADA 基因送入病人的骨髓細胞，或自體周邊淋巴球細胞，二年之後，在病人體內
之 T 及 B 淋巴球細胞中仍可測得到 ADA 基因的表現，甚至部份恢復其免疫功能（16）。
繼而有人嘗試以 CD34+之骨髓幹細胞進行基因轉殖，希望能維持終身性的治療效果。
Page 12
274
不過 CD34+細胞之基因轉殖及表現是較困難的（17）。針對 CD34 細胞，目前有許多載
體改良及轉殖技術改善仍在積極進行中。
(c) SCID—γc cytokine receptor 缺乏
嚴重性免疫不全症另一個發生原因是因為γc cytokine receptor 基因缺陷，造成
T 或 NK 細胞在早期分化過程中即受到阻礙。利用反轉錄病毒載體將此基因送入病人
之 CD34+細胞，的確可恢復 T、B，及 NK 細胞之正常數目而得到正常的免疫功能（18）。
這個結果是目前為止利用基因治療為主而得到良好治療效果之最具代表性例子。
(d) 囊性纖維化症（cystic fibrosis，CF）
囊性纖維化症起因於 CFTR（CF transmembrane conductance regulator）基因
缺陷，造成肺部表皮細胞對於電解質（electrolyte）之運送失去功能，導致肺部產生
膠黏液、感染、及發炎，通常是很容易致死的一個疾病。早期動物實驗嘗試利用腺病
毒載體攜帶正常 CFTR 基因至肺部之表皮細胞（19）。基因的表現雖然可以偵測得到，
但效率有限。且由於腺病毒載體所引發之強烈免疫反應根本也無法容許再做第二次或
第三次的基因傳送，故其效果非常有限。但後來改用微脂粒或腺相關病毒載體做為基
因傳送的工具，的確有部份病人因此得到相當長的一段時間能表現具有正常功能之
CFTR 基因產物，其疾病現象也獲得改善（20）。
2. 癌症腫瘤
癌症的發生，其實是經過一系列基因的突變所造成的。基因治療可以藉由先進的基因
轉殖技術，攜入某些基因到腫瘤細胞內，徹底改變其細胞型態及生長特性，達到清除腫瘤
的目的。目前用以治療腫瘤的策略大約可分為下列幾種：引入抑癌或細胞凋亡基因、引入
自殺基因、使用抗血管生成因子、使用免疫調控基因或利用複製型 oncolytic 病毒等等。
基於篇輻有限，作者只能簡單介紹各種策略的基本原理，有興趣的讀者不妨閱讀參考文獻
(21)，內有較為詳盡的介紹。
(a) 引入抑癌（tumor suppressor）或細胞凋亡（apoptosis）基因
腫瘤細胞最常見抑癌基因表現缺失的如 p53，RB1，BRCA1 等。實驗中證實將
野生型 (wild-type) 的這些基因送回這類的腫瘤細胞中，確實會造成腫瘤細胞停滯在
細胞週期的某一點或產生凋亡；或迫使細胞對傳統之化療或放射線療法更為敏感。臨
床試驗利用腺病毒載體進行 p53 基因治療例子中，的確在幾位患有非小細胞肺癌
（non-small-cell lung cancer）病患中看到有部份反應或保持病情在穩定的階段，證
明這個策略是可行的。
(b) 引入自殺基因
這個觀念是將自殺基因（suicide gene）特別地引入腫瘤細胞內，而不進入正常
Page 13
275
的細胞內，然後再處以特殊藥物。這些藥物經由自殺基因產物的作用而成為有毒的代
謝物，故會將表現自殺基因產物的腫瘤細胞殺死。最典型的例子就是一些 疹病毒之
thymidine kinase（HSV-tk）基因。這些病毒 tk 酵素會將一些核 酸類似物，例如
ganciclovir（GCV）或 acyclovir（ACV）進行磷酸化，導致這類產物得以被用為合成
DNA，造成 DNA 複製的終止，細胞於是死亡。但一般哺乳動物細胞內的 tk 酵素則不
具此能力，故不受 GCV 或 ACV 處理的影響。若是我們能將此 HSV-tk 只帶入腫瘤細
胞內，而不到正常細胞內，則 GCV 的處理當然只會殺死腫瘤細胞。至於如何只將 tk
基因帶入腫瘤細胞而非正常細胞，則視腫瘤種類、基因轉殖方式而定。最有名的例子
是利用反轉錄病毒載體攜帶 HSV-tk 基因進入腦瘤細胞。由於腫瘤細胞會不斷分裂，
而一般腦細胞均屬不分裂狀態，以反轉錄病毒只能感染分裂細胞的特性，是故腦瘤細
胞可被選擇性地消滅，而且由於有所謂的旁觀者效應（bystander effect）（22），事實上，
雖然未必每個腫瘤細胞都被帶入 HSV-tk 基因，但是腦瘤細胞被清除的效果卻出奇得
好。
(c) 使用抗血管生成因子(anti-angiogenic factor)
大部分腫瘤的生長都需要靠大量新生的血管來提供養份，故攻擊血管的生成或許
可成為一個治療腫瘤的良好方式。利用轉殖技術我們可以導入一些基因來抑制血管的
新生，或者破壞既有的血管，而達到抑制腫瘤生長的效果。這種治療策略的例子包括
利用反意（anti-sense）RNA 分子來降低血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial
growth factor, VEGF）的表現，或直接導入抗血管生成因子的基因，例如 angiostatin
或 endostatin。然而這種治療策略需有很好的轉殖技術或較長的表現時間，才能夠達
到較佳的效果。
(d) 使用免疫調控基因
腫瘤之所以形成，就代表免疫系統無視於它的存在。利用基因療法企圖增強免疫
機制，則是希望達到積極性的免疫刺激，使免疫系統能重新認識腫瘤的存在而加以清
除。有人利用細胞激素（cytokine, 如 IL-2，IL-12，GM-CSF 等）、輔助刺激分子
（co-stimulatory molecule,如 B7），或主要組織相容性（major histocompatibility,
MHC）等的基因來改造腫瘤細胞，將之做成為腫瘤細胞疫苗，用以免疫宿主，期能
重新刺激活化起宿主的免疫系統。不過目前實驗結果發現，這類免疫療法對小腫瘤效
果非常良好，且往往在宿主體內產生全身性、長效型的免疫反應，可預防腫瘤再復發。
但對於大的腫瘤，則完全沒有治療的效果（23）。歸究其原因，可能是有些大腫瘤已失
去 MHC 分子的表現，故不會被 T 細胞所辨識，或者這些大腫瘤可能會釋放一些免疫
抑制因子（immunosuppressive factors），抑制了免疫反應作用。基於如此，這類策
略在臨床上對較為末期的癌症病患而言，可能是無法發揮作用的。唯有將免疫基因療
法與其他基因治療策略或傳統療法合併使用，或許還可提供成為「佐劑」的效果，延
長或增強其他類療法的治療效果及時效。另一則想辦法將免疫活化能力再提高，俾能
Page 14
276
打破大腫瘤在宿主體內所造成的免疫耐受性。樹狀突細胞（dendritic cells, DC）的研
發或許可提供一個方向。目前 DC 在體外培養的技術已臻純熟，不少人即將腫瘤抗原
直接交賦 DC 呈現，以增強 T 細胞的活化。同時並也引入一些細胞激素的基因（例如
IL-12 或 GM-CSF），希望發揮更強之免疫佐劑功能。這種作法遠比將細胞激素基因
送入腫瘤細胞內更為有效。未來或許還可再研發一些其他類的免疫調控分子，適當地
在樹狀突細胞內表現，使樹狀突細胞在吞噬腫瘤抗原後，能更有效地成熟，以及移動
至淋巴器官去活化 T 細胞。
(e) 利用複製型 oncolytic 病毒殺死腫瘤
病毒在細胞內大量複製的結果可能就是造成細胞走向細胞凋亡，或產生裂解而釋
放出大量的病毒。利用病毒這種特性來消滅腫瘤細胞，並不是什麼新的想法，但是如
何有效地，選擇性地只殺死腫瘤細胞而不會殺死正常細胞，則是在最近基因治療載體
開發過程中又重新被重視及研究。
最有名的例子即是最近一株 E1B 缺陷的腺病毒（ONYX-015/dl1520）被發現在
p53 缺失或 p53 訊息傳導有缺陷之腫瘤細胞內具有大量複製的能力，而在 p53 正常
之細胞中則沒有複製的能力（24, 25）。利用這種特性，ONYX-015 被發現可以非常有效
地消滅多種腫瘤，例如頭頸腫瘤、脾臟腫瘤，卵巢癌等。若再搭配傳統之化療（例如
cisplatin 及 5-FU），則治療效果更是奇佳（26）。然而病毒這種具有複製及裂解細胞的
能力可能不太具有專一性，如此就會造成使用上安全性的疑慮。故有人在此類病毒載
體上再加以改造，使其更具有腫瘤標的性的效果；也有人使其帶有自殺基因、免疫調
控基因等，企圖綜合各種基因治療策略於一身。相信，如此一來，利用基因療法來治
療腫瘤就會更有希望了。除了腺病毒外，也有一些其他病毒，如 herpes simplex virus,
Newcastle disease virus, reovirus,或 vesicular stomatitis virus（VSV）可能也有類
似的效果，只是其造成細胞死亡的機制可能是不一樣的。
3. 感染性疾病—愛滋病
基因治療對於愛滋病的治療目標，是希望將病患體內之 T 細胞改換成為具有抵抗愛滋病
毒（HIV）感染能力之 T 細胞。其中最適合之標的細胞即為血液幹細胞，因為它可以分化出
後面許多的 T 細胞、B 細胞、巨噬細胞……等。一旦將抗病毒基因送入此類血液幹細胞就比
較能同時造就出一群具有抵抗 HIV 的下游細胞。
至於要用什麼基因來阻礙 HIV 的繁殖呢？一是將 RRE（rev-responsive element）片段
序列大量表現於標的細胞內，做成一個餌，將 HIV 複製所需之一個重要蛋白質 rev 大量引開、
耗盡，使其無法完成複製過程。另外則可引入某些特定 RNA 序列，使其與病毒某段基因序列
形成一個 ribozyme 的結構。這樣結構就會自動切斷病毒 RNA。也有人引入變種之病毒蛋白
基因。此變種蛋白具有強勢效果（trans-dominant），反而會干擾病毒正常蛋白的功能，如此
一來也可抑制病毒的複製。
Page 15
277
4. 心臟血管疾病
動脈血管壁上其實是一種多細胞所組成的結構，血管之平滑肌細胞（smooth muscle cell,
SMC）一般是不分裂的，它們控制著血流、血壓、血液凝固、栓塞等的問題。常在利用 balloon
進行血管造形術（angioplasty）之後，造成血管壁細胞創傷，而使 SMC 開始分裂增生；進
而造成血管變細、動脈硬化、血壓升高等之心臟血管疾病。在了解這些成因之後，目前有人
利用自殺基因，如 HSV-tk，來消除這些增生的細胞；也有人利用 Rb 基因來控制細胞的分裂；
或利用 NO 合成酵素來控制血管細胞的分裂。這些方法都提供了對心臟血管疾病有進一層的
控制作用。欲知更詳細介紹，可閱參考文獻 27。
5. 類風濕性關節炎
另有一些疾病目前利用基因治療策略也是有所斬獲的，例如類風濕性關節炎（rheumatoid
arthritis）。實驗證實關節炎發炎的因素，以 IL-1、TNF 及一些發炎相關激素在致病機制上是
扮演極重要的角色。如何抑制這類激素功能對於控制關節炎是很重要的。基因治療即利用轉
殖 TNF 之抗體基因或可溶性（soluble）之 TNF 受體（receptor）基因等來阻斷 TNF 之訊息
傳導，可以明顯降低發炎的現象。另也有人採用腺相關病毒載體系統於關節處攜入 IL-1 受體
之拮抗物（antagonist）基因，同樣具有降低類風濕性關節炎的效果。
四、結語
很明顯地，基因治療要成功，必須結合許多的技術。在這個領域中，它結合許多不同專
長、背景的人來共同達成：病毒學家、細胞生物學家、分子遺傳學家、免疫學家及臨床醫師。
唯有充分了解注意治療過程中的每一環節，才能避免再次發生類似在美國賓州費城的基因治
療死亡事件。病毒學家應再研發更安全、有效的載體系統，而細胞生物學家應再努力研究如
何培養幹細胞作為基因治療標的細胞，以減少病人治療的次數。免疫學家可再探討這麼多類
的病毒載體對人類的免疫作用究竟如何以及如何避免，以增加治療的成功機會。遺傳分子學
家應再探索基因與疾病之間的關係等等。雖然有太多的問題、知識仍待解決及尋求，但對一
些垂危的病人而言，基因治療技術的運用已箭在弦上，無法等待了。故唯有藉著目前一邊進
行中的臨床試驗的結果及經驗，配合各個實驗室內汲汲不斷的努力研究，才能將基因治療推
向更易成功、更易執行的境界。希望有一天，基因治療是可以在每間大小醫院都可輕易執行
的臨床工作之一，而它也可以針對許多目前無藥可治的病症提供另一線的曙光。
五、參考文獻
1. Chen, S. T., Iida, A., Guo, L., Friedmann, T., and Yee, J. K. (1996). Generation of packaging
cell lines for pseudotyped retroviral vectors of the G protein of vesicular stomatitis virus by
using a modified tetracycline inducible system. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93,
10057-10062.
2. Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono,
D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral
vector, Science 272, 263-267.
Page 16
278
3. Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., and Naldini, L. (2000). Gene transfer by
lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat.
Genet. 25, 217-222.
4. Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., and Hope, T. J. (1999). Woodchuck hepatitis virus
posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by
retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892.
5. Engelhardt, J. F., Ye, X., Doranz, B., and Wilson, J. M. (1994). Ablation of E2A in recombinant
adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in
mouse liver. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91, 6196-6200.
6. Lieber, A., He, C. Y., Kirillova, I., and Kay, M. A. (1996). Recombinant adenoviruses with large
deletions generated by Cre-mediated excision exhibit different biological properties compared
with first-generation vectors in vitro and in vivo. J. Virol. 70, 8944-8960.
7. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., and Owens, R. A. (1994). Adeno-associated
virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration
site in human DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91, 5808-5812.
8. Sun, L., Li, J., and Xiao, X. (2000). Overcoming adeno-associated virus vector size limitation
through viral DNA heterodimerization. Nat. Med. 6, 599-602.
9. Nakai, H., Storm, T. A., and Kay, M. A. (2000). Increasing the size of rAAV-mediated
expression cassettes in vivo by intermolecular joining of two complementary vectors. Nat.
Biotechnol. 18, 527-532.
10. Frenkel, N., Singer, O., and Kwong, A. D. (1994). Minireview: the herpes simplex virus
amplicon--a versatile defective virus vector. Gene Ther. 1, S40-46.
11. Hewson, R. (2000). RNA viruses: emerging vectors for vaccination and gene therapy. Mol.
Med. Today 6, 28-35.
12. Felgner, P. L. (1997). Nonviral strategies for gene therapy. Sci. Am. 276, 102-106.
13. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., and McCabe, D. (1990). In vivo and in
vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A 87, 9568-9572.
14. Chang, D.C., Chassy, B.M., and Saunders J.A. (1992). Guide to electroporation and
electrofusion. New York: Academic Press.
15. Ohashi, T., Boggs, S., Robbins, P., Bahnson, A., Patrene, K., Wei, F. S., Wei, J. F., Li, J.,
Lucht, L., Fei, Y., and et al. (1992). Efficient transfer and sustained high expression of the
human glucocerebrosidase gene in mice and their functional macrophages following
transplantation of bone marrow transduced by a retroviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A
89, 11332-11336.
16. Bordignon, C., Notarangelo, L. D., Nobili, N., Ferrari, G., Casorati, G., Panina, P., Mazzolari,
E., Maggioni, D., Rossi, C., Servida, P., and et al. (1995). Gene therapy in peripheral blood
lymphocytes and bone marrow for ADA- immunodeficient patients. Science 270, 470-475.
Page 17
279
17. Hoogerbrugge, P. M., van Beusechem, V. W., Fischer, A., Debree, M., le Deist, F., Perignon, J.
L., Morgan, G., Gaspar, B., Fairbanks, L. D., Skeoch, C. H., Moseley, A., Harvey, M., Levinsky,
R. J., and Valerio, D. (1996). Bone marrow gene transfer in three patients with adenosine
deaminase deficiency. Gene Ther. 3, 179-183.
18. Cavazzana-Calvo, M., Hacein-Bey, S., de Saint Basile, G., Gross, F., Yvon, E., Nusbaum, P.,
Selz, F., Hue, C., Certain, S., Casanova, J. L., Bousso, P., Deist, F. L., and Fischer, A. (2000).
Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 288,
669-672.
19. Rosenfeld, M. A., Yoshimura, K., Trapnell, B. C., Yoneyama, K., Rosenthal, E. R., Dalemans,
W., Fukayama, M., Bargon, J., Stier, L. E., Stratford-Perricaudet, L., and et al. (1992). In vivo
transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway
epithelium. Cell 68, 143-155.
20. Porteous, D. J., Dorin, J. R., McLachlan, G., Davidson-Smith, H., Davidson, H., Stevenson, B.
J., Carothers, A. D., Wallace, W. A., Moralee, S., Hoenes, C., Kallmeyer, G., Michaelis, U.,
Naujoks, K., Ho, L. P., Samways, J. M., Imrie, M., Greening, A. P., and Innes, J. A. (1997).
Evidence for safety and efficacy of DOTAP cationic liposome mediated CFTR gene transfer to
the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Gene Ther. 4, 210-218.
21. 黃麗華. (2001).〝癌症的基因治療〞於台灣醫學 第五卷第 1 期，p65 ~ p74.
22. Lashford, L. S. (1997). Possibilities of gene therapies for cancer. Ann. Med. 29, 1-4.
23. Hsieh, C. L., Chen, D. S., and Hwang, L. H.(2000). Tumor-induced immunosuppression: a
barrier to immunotherapy of large tumors by cytokine-secreting tumor vaccine. Hum. Gene
Ther. 11, 681-692.
24. Heise, C., Sampson-Johannes, A., Williams, A., McCormick, F., Von Hoff, D. D., and Kirn, D.
H. (1997). ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis
and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nat.
Med. 3, 639-645.
25. Bischoff, J. R., Kirn, D. H., Williams, A., Heise, C., Horn, S., Muna, M., Ng, L., Nye, J. A.,
Sampson-Johannes, A., Fattaey, A., and McCormick, F. (1996). An adenovirus mutant that
replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science 274, 373-376.
26. Khuri, F. R., Nemunaitis, J., Ganly, I., Arseneau, J., Tannock, I. F., Romel, L., Gore, M.,
Ironside, J., MacDougall, R. H., Heise, C., Randlev, B., Gillenwater, A. M., Bruso, P., Kaye, S.
B., Hong, W. K., and Kirn, D. H. (2000). A controlled trial of intratumoral ONYX-015, a
selectively-replicating adenovirus, in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients
with recurrent head and neck cancer. Nat. Med. 6, 879-885.
27. 江福田. (2001). 〝心血管疾病的基因治療〞於 台灣醫學 第五卷第 1 期，p60 ~ p64.
Page 18
280
No comments:
Post a Comment