五、探针的制备
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探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单 ...
探针标记的原理 - 医流比价网
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2011年8月22日 - 探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基探针是能 ...
探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。
探针标记方法有：①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5′端核苷酸，同时在3′端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。
探针合成的注意事项有：①合成探针的长短，一般在20~50个核苷酸之间。合成过长成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长，合成太短则特异性下降。②碱基组成G-C应含40%~60%，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。③探针自身序列内应无互补区域，以免产生“发夹”结构，影响杂交。总之，一个好的探针最终要在实践中才能加以确认
原文链接：Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility
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探针标记方法有：①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5′端核苷酸，同时在3′端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。
探针合成的注意事项有：①合成探针的长短，一般在20~50个核苷酸之间。合成过长成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长，合成太短则特异性下降。②碱基组成G-C应含40%~60%，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。③探针自身序列内应无互补区域，以免产生“发夹”结构，影响杂交。总之，一个好的探针最终要在实践中才能加以确认
Cell：看DNA玩转溜溜球游戏
为了让两米的DNA塞进微型的细胞中，细胞必须极其仔细地将遗传信息链绕成染色体。令人惊讶的是，研究人员发现DNA序列使得它像溜溜球(yoyo)一样地缠绕和解缠绕。相关研究发布在3月12日的《细胞》(Cell)杂志上。
伊利诺伊大学物理学教授、Carl R. Woese基因组生物学研究所成员Taekjip Ha说：“我们发现了这一有趣的DNA物理现象：它的序列决定了细胞内DNA包装的柔性和稳定性。这实际上是非常基本的DNA物理现象。尽管许多人认为我们在几十年前就应该认识到了这一DNA物理现象，但其中仍有惊喜。”
DNA被包装成像串珠手链一样的染色体。DNA缠绕着组蛋白形成核小体。这些核小体被编成串珠链，再被精致地编织成染色体。
科学家们早就知道DNA可以从核小体解缠绕，但他们一直猜测两端是对称的，即DNA解缠绕应该像是解鞋带一样。伊利诺伊大学的研究人员发现，DNA实际上非常不对称，就像是缠绕着溜溜球的绳子。拉动DNA的一端只会让缠绕变紧，而拉动另一端则会使得它像溜溜球一样的解缠绕。
核小体包装的这种物理现象是由DNA序列所决定，它使得DNA链足具柔性得以满足两个相互冲突的原理：它必须足够稳定使得DNA密实紧凑，也必须足够动态使得DNA链能够解缠绕，被读取而生成蛋白质。
Ha说：“许多的研究表明，如果你改变基因的序列，将会影响其他的东西，例如有可能生成不同的蛋白质。但却没有人真正地思考序列改变对于DNA物理学的影响，后者转而引起了生物学改变。”
Ha的研究表明，细胞的蛋白质制造机器更容易从较易解缠绕的核小体“弱”端开始读取。他们认为与癌症等疾病相关的一些遗传突变改变了核小体的稳定性。
“这有可能对如何读取信息以及生成不同的蛋白造成了重大的影响。例如，有可能根据突变引起的DNA柔性和稳定性的改变差异性地生成了抗癌蛋白或是致癌蛋白，”Ha说。
接下来Ha打算利用下一代测序来确定整个基因组的柔性。他希望能够构建出第一个全基因组的物理性质图谱。他还想搞清楚一些突变是导致了DNA更容易还是更难读取。
原文链接：Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility
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