將baculovirus linear DNA 和
recombinant plasmid 利用
transfection reagent 來做 cotransfection
到昆蟲細胞裡面進
行同源重組，以獲得重組病毒
Target gene
將Target gene 接到transfer
vector 上，得到recombinant
收取細胞的上清液，內含重組
病毒
用收取的上清液測定病毒濃
度後來感染細胞，若之前在
recombinant plasmid 內有裝
入螢光蛋白來當reporter，則
可以用螢光顯微鏡來觀察感
染的狀況；若無螢光當
reporter，則可以用高倍率來
看細胞內是否有病毒顆粒形
利用PAGE 和western 來確
認重組蛋白的產量，之後大
量感染純化收取重組蛋白
www.hbmsp.sipa.gov.tw/BIOEpaper/epaper/more_show.jsp?id=599
2012年8月6日 - 目前有很多細胞轉染(cell transfection)的技術已經被發展出來，一些基因 ... 細胞轉染的技術包含有病毒載體(viral vectors)，化學性的方法和物理性的 ...
www.bio-protech.com.tw/databank/.../桿狀病毒專刊_110614.pdf
桿狀病毒分成兩種不同的複製生活史，一為產生出芽病毒(budded virus, BV)，另一. 為包涵體 ... DNA，再經由細胞的轉染(transfection)過程，即可複製完成具有感. 染能力的 .... Baculovirus Transfer Vectors for Incect Cell Expression System: pAcIRES ...
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 | 基因療法在基因遞送上的突破性進展/ Breakthrough in gene delivery for gene therapy
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摘要 :
The Ohio State University team has successfully used nanochannel electroporation (NAP), to deliver drug particles, and use duration and intensity of pulse to control the delivered drug dosage. Compared to many current cell transfer technologies, nanochannel electroporation causes less cell death, and its precision control of dosage is also a big advantage.
俄亥俄州立大學團隊成功利用奈米管道電穿孔法((nanochannel electroporation, NEP)進行分子藥物的遞送，透過脈衝的時間長短和強度來控制藥物遞送的劑量，相較於許多現有的細胞轉染(cell transfection)技術，奈米管道電穿孔法不易造成細胞死亡，可精確控制劑量更是一大優勢。
本文 :
【Nature nanotechnology】公佈了一份研究報告，此報告對於基因療法在基因遞送系統上有突破性的進展。此篇論文的作者是俄亥俄州立大學L. James Lee博士的團隊，他們成功展示了利用奈米管道電穿孔法(nanochannel electroporation, NEP)進行分子藥物的遞送。這是第一次科學家不需要使用注射針頭，就可以針對一個單獨的活細胞進行精確定量的藥物遞送。
目前有很多細胞轉染(cell transfection)的技術已經被發展出來，一些基因素材(如，plasmid DNA or siRNA constructs )或蛋白質(如，抗體)可以透過細胞轉染的技術轉植入細胞內。細胞轉染的技術包含有病毒載體(viral vectors)，化學性的方法和物理性的方法。化學性的方法包含有與脂質混合成微脂體(liposomes)或混合磷酸鈣(calcium phosphate)、聚陽離子(polycations)、鹼性蛋白質(basic proteins)等。物理性的方法包含有微注射法(micro-injection)和電穿孔法(electroporation)等。這些技術除了微注射法之外，都是利用大量的分子藥物(如，基因)進行隨機的轉染，因此無法對進入細胞內的分子藥物劑量進行控制，而這個施用劑量無法精密控制的缺點是這些方法的一大致命傷。另外，雖然微注射法可以對施用劑量進行精密的控制，可是大部分的人類細胞都太微小了，以致於連最細的針頭都無法發揮作用。
為了克服上述的問題L. James Lee博士的團隊發展了奈米管道電穿孔法來進行分子藥物之精確定量的遞送，這個技術是將一個相鄰於奈米管道的細胞之細胞膜上的超微小區域，施加以大的局部電場造成電穿孔，讓分子藥物直接從奈米管道進入細胞質中。在進行奈米管道電穿孔法的電子裝置中，奈米管道的兩端分別是兩個微管道(microchannel)，其中一個是用來裝載定量過後的分子藥物，另外一個微管道與光鑷系統(optical tweezers system)連接，用來將一個細胞放入微管道中，並將細胞固定在微管道的頂端，在進行電穿孔之前，光鑷系統會被移除。奈米管道的製作是透過解開螺旋的DNA，將之外面包覆金(stretched gold-coated DNA strands)，當作奈米管道的模板(template)，兩端各連接一個微管道模板，然後經過轉印(imprinting)與蝕刻(Etching)之後，會在玻璃上的高分子樹脂材料中形成一個被金所包覆的奈米管道，兩端各連接一個微管道。最後再將電極與微管道相連接。據此報告所展示的模式系統，奈米管道直徑約90奈米，長約3微米。
此篇論文中，經由測試可以觀察到在短短幾毫秒或千分之ㄧ秒就可以完成藥物的遞送。首先，他們將人工合成的DNA用螢光標定，以奈米管道電穿孔法將之送入人類免疫細胞，在一個五毫秒的脈衝過後，他們觀察到螢光點散佈在細胞中，如果脈衝延長到60毫秒，則細胞就會充滿螢光。另外，為了測試奈米管道電穿孔法是否可以用來遞送治療性的藥物，於是他們將RNA藥物[siRNA(Mcl-1)]送入白血病細胞中，去抑制Mcl-1基因的表現，發現只要5毫秒就可以遞送足夠量的RNA分子去殺死癌細胞，如果是接近10毫秒的脈衝，則幾乎會殺死所有的癌細胞。他們同時也遞送無害的RNA進入白血病細胞中作比較，可以發現這些癌細胞都存活下來。奈米管道電穿孔法是透過脈衝的時間長短和強度來控制藥物遞送的劑量。
傳統電穿孔法(Bulk electroporation or microfluidics-based electroporation)之分子藥物是靠擴散作用才能從電穿孔進入細胞，而奈米管道電穿孔法不需要靠擴散作用，就直接讓分子藥物從奈米管道進入細胞。因此，在與奈米管道相連接的微管道裝載精準定量後的分子藥物，就可以透過電壓的控制來對細胞進行精準劑量的投遞。除此之外，奈米管道電穿孔法是在細胞膜上之超微小區域施加以局部大電場，細胞膜受影響的區域低於微流體電穿孔法(microfluidics-based electroporation)所造成的百分之一不到，奈米管道電穿孔法會在鄰近奈米管道的細胞膜上造成一個較大的洞或幾個較小的洞，傳統電穿孔法則會產生大量的小洞，受影響的細胞膜區域佔總面積的比例很高，因此傳統電穿孔法容易造成細胞的死亡，而此篇研究報告指出奈米管道電穿孔法的實驗並沒有觀察到任何細胞的死亡。還有一點是奈米管道電穿孔法與傳統電穿孔法不同的地方，是使用奈米管道電穿孔法的分子藥物是透過較大的電穿孔將較大的藥物直接送入細胞質中，而傳統電穿孔法則是由於較小的電穿孔，會造成較大分子藥物是經過內噬作用而進入內噬體中(endocytosis-to-endosome)。
目前這項研究成果仍是屬於實驗室階段，一次只能同時針對一個或幾個細胞施行。L. James Lee博士和他的團隊正在發展可以同時針對很多細胞施行的方法，如機械化系統，一次可以針對10萬個細胞進行施作的，希望可以增加臨床診斷與治療的可能性。
出處與延伸閱讀：
2012年8月6日
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