把基因表达的工作交给病毒载体[选购宝典]
摘要：
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
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为了将外源的核酸导入细胞，人们常常采用化学转染和电穿孔的方法。随着细胞调控的谜团不断被解开，神经细胞、干细胞、原代细胞以及一些不分裂的真核细胞也成为实验中的宠儿。不幸的是，这些细胞类型却并不配合标准的转染方法。研究人员要么放弃他们的研究，要么接受低转染效率。其实，他们还有一个选择，那就是病毒转导。
据斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）免疫学和微生物学教授John Elder介绍，病毒载体的存在已有数亿年。现代的实验室已经驯服了病毒，确保它既安全又有效，同时利用其能力来转导高比例的细胞。
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
制备病毒
利用病毒作为载体就已经很吓人了，更别说制备病毒。人们不禁会问，这安全吗？其实科学家早已准备好各种防范措施，比如将病毒复制所需的基因和关键调控元件分离，这样它们就不会被包装成病毒颗粒，不受控制地感染和复制。同时，使用适当的生物安全设备以及处理病毒的标准做法，能减轻病毒载体造成伤害的机会。这些复制缺陷型的载体已逐渐成为标准工具，来执行细胞内成像、基因编辑和蛋白生产的任务。
研究人员可以从多家供应商购买到现成或定制的载体。Vector Biolabs的首席运营官X.D. Shao表示，它们通常是以病毒储液的形式提供的，可直接加入细胞或注射到动物中。由于腺病毒（与慢病毒和AAV不同）在特殊的包装细胞中可以复制，有时它也以病毒种子储液提供，这样科学家就能够不断产生载体。
另一种获得病毒载体的方法是购买质粒，它包含必需的调控元件和启动子（在某些情况下可诱导），以及可选的标签，协助用户观察和纯化所产生的病毒颗粒。许多质粒是立即可用的，包含特异的目的基因（GOI），或者为RNAi、shRNA或CRISPR/Cas9应用而设计。这些质粒可以是现成的产品，也可以从不同的公司订购，包括Vector Biolabs、GeneCopoeia和Cell Biolabs。
Shao认为，制备病毒载体需要对分子生物学、细胞生物学以及病毒学有一定的了解，如果实验室内部有这方面的知识，他们肯定能够自己制备病毒。多家公司的试剂盒都提供了所需的一切。
摘要：
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
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据斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）免疫学和微生物学教授John Elder介绍，病毒载体的存在已有数亿年。现代的实验室已经驯服了病毒，确保它既安全又有效，同时利用其能力来转导高比例的细胞。
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
制备病毒
利用病毒作为载体就已经很吓人了，更别说制备病毒。人们不禁会问，这安全吗？其实科学家早已准备好各种防范措施，比如将病毒复制所需的基因和关键调控元件分离，这样它们就不会被包装成病毒颗粒，不受控制地感染和复制。同时，使用适当的生物安全设备以及处理病毒的标准做法，能减轻病毒载体造成伤害的机会。这些复制缺陷型的载体已逐渐成为标准工具，来执行细胞内成像、基因编辑和蛋白生产的任务。
研究人员可以从多家供应商购买到现成或定制的载体。Vector Biolabs的首席运营官X.D. Shao表示，它们通常是以病毒储液的形式提供的，可直接加入细胞或注射到动物中。由于腺病毒（与慢病毒和AAV不同）在特殊的包装细胞中可以复制，有时它也以病毒种子储液提供，这样科学家就能够不断产生载体。
另一种获得病毒载体的方法是购买质粒，它包含必需的调控元件和启动子（在某些情况下可诱导），以及可选的标签，协助用户观察和纯化所产生的病毒颗粒。许多质粒是立即可用的，包含特异的目的基因（GOI），或者为RNAi、shRNA或CRISPR/Cas9应用而设计。这些质粒可以是现成的产品，也可以从不同的公司订购，包括Vector Biolabs、GeneCopoeia和Cell Biolabs。
Shao认为，制备病毒载体需要对分子生物学、细胞生物学以及病毒学有一定的了解，如果实验室内部有这方面的知识，他们肯定能够自己制备病毒。多家公司的试剂盒都提供了所需的一切。
把基因表达的工作交给病毒载体[选购宝典]
摘要：
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
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按部就班
典型的流程是：将你想要表达的GOI或想要干扰的RNA克隆到质粒载体上，进行某种筛选，如抗生素耐药性。随后用质粒转化细菌、铺板，并挑选出阳性克隆，确认包含GOI。接着就是扩增，并收集质粒。下一步是将这个质粒与其他一些质粒一起共转染细胞，通常是HEK细胞的衍生物。
慢病毒会分泌到上清中，“你只需要收集上清，并直接使用”，GE Healthcare的Dharmacon研发部门的资深科学家Melissa Kelley谈道。上清中通常含有细胞碎片，而滴度也不是很高，因此许多研究人员会进行纯化和浓缩。这取决于你的应用以及细胞的敏感性。对于AAV和腺病毒，病毒的收集需要对细胞进行反复冻融，接着是低速离心。
浓缩和纯化病毒的标准方法是超速离心，不过这耗时耗力，通量也低。Vectalys的CEO Pascale Bouillé认为，这不是一个工业过程。这家公司提供即用型的慢病毒颗粒，滴度在每毫升109个颗粒。对于那些打算用在体内的载体，他们还会增加一步层析纯化。Bouillé提醒说，并非所有的公司都提供相同纯度或滴度的载体，客户也要注意滴度测定的方式。
那些自己生产病毒载体的实验室也能使用一些公司的纯化试剂盒，包括Takara Clontech、Cell Biolabs、Applied Biological Materials和Sartorius。Bouillé认为这些最适合需要少量载体的科研用户。
如何选择
这三种载体类型有许多相似之处，包括它们能转导静止和分裂的细胞，以及能感染大多数的细胞类型。不过，它们之间也有几个主要的不同点。慢病毒整合到细胞的基因组，而腺病毒和AAV通常是游离的。对于腺病毒和AAV而言，前者主要应用在体外，而后者应用在体内。一般来说，AAV只能接受小的插入片段，大约在4.5 kb，但腺病毒能包装8 kb，而慢病毒则达到10 kb。
Kelley认为，慢病毒和腺病毒的选择在于实验的要求。例如，慢病毒能够产生稳定的细胞系，而不需要筛选；然而，它也存在整合的风险，可能导致有害突变。另一方面，腺病毒会表达其他基因。这是它在体内应用中不受欢迎的原因。
科学家们试图更好地了解基因表达的体内调控机制，而神经细胞、干细胞和原代细胞就成了必不可少的工具。然而，这些细胞难以用传统的方法转染。如果你想要检查GOI的表达，但无法让DNA进入你的细胞，那么别害怕。把它交给病毒吧！
（作者：Josh P. Roberts/生物通编译）
摘要：
多年来，这一领域主要围绕着三种病毒：腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（lenti），每一种都有其自己的优势和不足。下面，我们就来了解一下病毒载体的各个方面，每种类型有哪些特征，以及它们最适合哪些应用。
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按部就班
典型的流程是：将你想要表达的GOI或想要干扰的RNA克隆到质粒载体上，进行某种筛选，如抗生素耐药性。随后用质粒转化细菌、铺板，并挑选出阳性克隆，确认包含GOI。接着就是扩增，并收集质粒。下一步是将这个质粒与其他一些质粒一起共转染细胞，通常是HEK细胞的衍生物。
慢病毒会分泌到上清中，“你只需要收集上清，并直接使用”，GE Healthcare的Dharmacon研发部门的资深科学家Melissa Kelley谈道。上清中通常含有细胞碎片，而滴度也不是很高，因此许多研究人员会进行纯化和浓缩。这取决于你的应用以及细胞的敏感性。对于AAV和腺病毒，病毒的收集需要对细胞进行反复冻融，接着是低速离心。
浓缩和纯化病毒的标准方法是超速离心，不过这耗时耗力，通量也低。Vectalys的CEO Pascale Bouillé认为，这不是一个工业过程。这家公司提供即用型的慢病毒颗粒，滴度在每毫升109个颗粒。对于那些打算用在体内的载体，他们还会增加一步层析纯化。Bouillé提醒说，并非所有的公司都提供相同纯度或滴度的载体，客户也要注意滴度测定的方式。
那些自己生产病毒载体的实验室也能使用一些公司的纯化试剂盒，包括Takara Clontech、Cell Biolabs、Applied Biological Materials和Sartorius。Bouillé认为这些最适合需要少量载体的科研用户。
如何选择
这三种载体类型有许多相似之处，包括它们能转导静止和分裂的细胞，以及能感染大多数的细胞类型。不过，它们之间也有几个主要的不同点。慢病毒整合到细胞的基因组，而腺病毒和AAV通常是游离的。对于腺病毒和AAV而言，前者主要应用在体外，而后者应用在体内。一般来说，AAV只能接受小的插入片段，大约在4.5 kb，但腺病毒能包装8 kb，而慢病毒则达到10 kb。
Kelley认为，慢病毒和腺病毒的选择在于实验的要求。例如，慢病毒能够产生稳定的细胞系，而不需要筛选；然而，它也存在整合的风险，可能导致有害突变。另一方面，腺病毒会表达其他基因。这是它在体内应用中不受欢迎的原因。
科学家们试图更好地了解基因表达的体内调控机制，而神经细胞、干细胞和原代细胞就成了必不可少的工具。然而，这些细胞难以用传统的方法转染。如果你想要检查GOI的表达，但无法让DNA进入你的细胞，那么别害怕。把它交给病毒吧！
（作者：Josh P. Roberts/生物通编译）
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