「超分辨荧光显微技术」指的是哪些呢？与普通的荧光显微技术相比，实现了哪些技术突破？以及具体应用于哪些工作场景？为该工作的开展带来了怎么样的改变？
此问主要从技术层面讨论，如不过瘾还请关注系列问题：
2014 年诺贝尔化学奖「超分辨荧光显微技术」的「化学」含量有多少？
如何评价2014年诺贝尔化学奖?
此问主要从技术层面讨论，如不过瘾还请关注系列问题：
2014 年诺贝尔化学奖「超分辨荧光显微技术」的「化学」含量有多少？
如何评价2014年诺贝尔化学奖?
泻药，慢慢填坑ing。补充其余的几个答案。
![]()
普通的荧光显微技术，采用荧光染料对特定的组织细胞进行染色，或者使用特定的荧光蛋白，通常采用汞灯激发荧光，相比与普通的光学显微镜大大提高了图像对比度。但也面临着存在荧光漂白，缺乏深度信息等。改进后的有激光共聚焦扫描(Confocal)、多光子荧光扫描显微镜(Muti-photon)等，大大提高了分辨率或成像深度，不过依然受到光学衍射极限的限制。
电子显微镜可以突破衍射极限，但是不适合对生物样品成像，更不可能活体成像；一些近场显微的方法也能突破衍射极限，但是扫描速度通常很慢，而且只能对样品的表面信息成像，无法探测深度信息。目前在远场突破衍射极限的光学显微方法大约可以两大类：
![]()
超分辨光学显微实验室（Superresolution Optical Microscopy Lab）
ZEISS Microscopy Online Campus![]()
STED的理论分辨能力公式为：
是STED光光强极大值，
为荧光分子饱和激发光强。理论上来说，只要光强允许无限增加，分辨率没有极限。
![]()
目前世界领先（就是这次获奖的Hell小组）的分辨率已经在几个纳米级别了。国内的话，师从Hell的北大席鹏小组大约在60nm(2012年)；浙大的刘旭、匡翠芳小组的G-STED系统约为38nm(2013年)。
基于STED的原理，又有相似的几种方法被发明出来：
![]()
激发态吸收(Excited State Absorption, ESA)
ESA是将已经在激发态中的电子，通过环形的激发光继续激发使其到达更高的能级单重态中，于是也就将中心点的荧光区分开来了，达到了降低点扩散函数的目的。
基态清空(Ground State Depletion, GSD)
GSD是刚开始就把周围的粒子通过一个强激发使他们获得很高的能量，让他们慢慢自己回到一个不发光的三重态，这时候能够被激发的就只有中心的粒子，也就自然而然地减小了点扩展函数。
STED/ESA/GSD/等技术被Hell统称为RESOLFT(reversible saturable/switchable optical transitions) 可逆饱和/开关光跃迁
目前，STED技术已经被德国Leica公司买去成功商业化，商业系统的分辨率在80nm以下。Leica TCS SP8 STED 3X
以下待填坑
- 「衍射极限」，由于光的波动性，普通光学仪器的分辨率受限与工作波长和数值孔径，其分辨率大约在为光的波长量级。聚焦光斑点点扩散函数(PSF)描述了系统的分辨率。
- 「荧光」是光致发光效应的一种，在电子受激进入不同的电子单重态S2后，通过无辐射的系内转换等进入能量稍低的第一激发单重态S1中，再通过振动弛豫的方式到达S1中能量最低的振动能级上，然后回到基态的振动能级中并发射出光子。如下图Jablonski 能图所示
普通的荧光显微技术，采用荧光染料对特定的组织细胞进行染色，或者使用特定的荧光蛋白，通常采用汞灯激发荧光，相比与普通的光学显微镜大大提高了图像对比度。但也面临着存在荧光漂白，缺乏深度信息等。改进后的有激光共聚焦扫描(Confocal)、多光子荧光扫描显微镜(Muti-photon)等，大大提高了分辨率或成像深度，不过依然受到光学衍射极限的限制。
电子显微镜可以突破衍射极限，但是不适合对生物样品成像，更不可能活体成像；一些近场显微的方法也能突破衍射极限，但是扫描速度通常很慢，而且只能对样品的表面信息成像，无法探测深度信息。目前在远场突破衍射极限的光学显微方法大约可以两大类：
- 改变激发光的点扩散函数，比如STED, SIM
- 单分子成像技术，比如PALM, STORM
- 受激发射损耗显微技术(STimulated Emission Depletion, STED)
超分辨光学显微实验室（Superresolution Optical Microscopy Lab）
ZEISS Microscopy Online Campus
激发射损耗显微镜(STED)其基本原理如下图所示, 紫色代表的是激发激光，绿色代表的是用来受激发射损耗的激光，两束激光经过时间空间调制后同时照射在样本上。激发光使荧光物质发光的同时，STED激光发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将激发光斑中大部分的荧光物质通过光学非线性作用被强行回到基态抑制其发荧光，从而减少荧光发射光斑面积。激发光光斑经STED激光的调制后大大的减少了发射荧光分子的光斑大小，并且随着STED激光光强的增加，能发射荧光光斑越小，其半高全宽可以达到衍射极限以下，分辨率不再受光的衍射所限制，从而打破衍射极限。通过三维扫描可以得到50nm以下的三维图像。
STED的理论分辨能力公式为：
目前世界领先（就是这次获奖的Hell小组）的分辨率已经在几个纳米级别了。国内的话，师从Hell的北大席鹏小组大约在60nm(2012年)；浙大的刘旭、匡翠芳小组的G-STED系统约为38nm(2013年)。
基于STED的原理，又有相似的几种方法被发明出来：
激发态吸收(Excited State Absorption, ESA)ESA是将已经在激发态中的电子，通过环形的激发光继续激发使其到达更高的能级单重态中，于是也就将中心点的荧光区分开来了，达到了降低点扩散函数的目的。
基态清空(Ground State Depletion, GSD)
GSD是刚开始就把周围的粒子通过一个强激发使他们获得很高的能量，让他们慢慢自己回到一个不发光的三重态，这时候能够被激发的就只有中心的粒子，也就自然而然地减小了点扩展函数。
STED/ESA/GSD/等技术被Hell统称为RESOLFT(reversible saturable/switchable optical transitions) 可逆饱和/开关光跃迁
目前，STED技术已经被德国Leica公司买去成功商业化，商业系统的分辨率在80nm以下。Leica TCS SP8 STED 3X
以下待填坑
- 结构照明显微技术(Structure Illumination Microscopy, SIM)
- 光激活定位显微技术(PhotoActivated Localization Microscopy, PALM)
- 随机光学重构显微技术 (STochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)
No comments:
Post a Comment